[發(fā)明專利]一種大腸桿菌聯(lián)產苯丙酸與肉桂醇的方法

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• 申請日: 2021-12-12
• 公開（公告）號: CN116286563A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設計）人: 孫婧
• 申請（專利權）人: 江蘇師范大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/60;C12N15/52;C12N15/70;C12N15/66;C12P7/40;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 徐州先卓知識產權代理事務所(普通合伙) 32555
• 代理人: 陳俊杰

一種大腸桿菌聯(lián)產苯丙酸與肉桂醇的方法，通過向兩株原始或改造過的大腸桿菌中導入途徑中不同的基因來實現苯丙酸和肉桂醇的聯(lián)合生產，一株通過向大腸桿菌中導入一條表達酪氨酸解氨酶，烯酸還原酶生產苯丙酸的途徑，另一株菌為通過向大腸桿菌中中導入肉桂酰輔酶A還原酶，醇脫氫酶，香豆酰輔酶A連接酶，全細胞催化肉桂酸合成肉桂醇，并通過選擇合適的共培養(yǎng)兩株菌的培養(yǎng)條件提高了產量。本發(fā)明能夠實現苯丙酸和肉桂醇的聯(lián)產，減少中間產物的合成，同時培養(yǎng)基成分簡單利于后續(xù)處理，從而有利于降低生產成本。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種大腸桿菌聯(lián)產苯丙酸與肉桂醇的方法。

背景技術

苯丙酸常用作香料或添加于調味品中，也應用于醫(yī)藥領域。肉桂醇因其香氣和特性成為一種用途廣泛的化學品，用于香料和調味品行業(yè)，用來形成肉桂香調和相似的水果香氣。它也可以用作生產有香氣的酯的中間體、用于合成紫杉醇的C13側鏈、合成抗生素和抗抑郁藥瑞波西汀甲磺酸鹽。目前苯丙酸和肉桂醇的生產依賴化學法，通常以肉桂酸為前體，成本較高，且產物分離困難，并且對環(huán)境不友好。同時苯丙酸和肉桂醇都是肉桂酸的衍生物，但在同時合成兩者時存在中間產物。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供聯(lián)產苯丙酸和肉桂醇的共培養(yǎng)的兩株菌，一株通過向大腸桿菌中導入一條表達酪氨酸解氨酶，烯酸還原酶生產苯丙酸的途徑，另一株菌為通過向大腸桿菌中中導入肉桂酰輔酶A還原酶，醇脫氫酶，香豆酰輔酶A連接酶，全細胞催化肉桂酸合成肉桂醇。

本發(fā)明的又一目的是提供一種共培養(yǎng)的方法，通過向兩株原始或改造過的大腸桿菌中導入途徑中不同的基因來實現苯丙酸和肉桂醇的聯(lián)合生產，并通過優(yōu)化共培養(yǎng)兩株菌的培養(yǎng)條件提高產量。

為實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術方案具體如下：

一種大腸桿菌聯(lián)產苯丙酸與肉桂醇的方法，包括：

向一株大腸桿菌中導入導入酪氨酸解氨酶(TAL)、烯酸還原酶(ER)的相應基因，向另一株大腸桿菌中中導入香豆酰輔酶A連接酶(4CL)，肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)，醇脫氫酶(ADH)的相應基因，之后共培養(yǎng)兩株大腸桿菌獲得苯丙酸和肉桂醇。

進一步的，包括步驟：

(1)向大腸桿菌一中導入酪氨酸解氨酶(TAL)，烯酸還原酶(ER)的相應基因，從發(fā)酵液中取樣，利用高效液相色譜對產物濃度進行分析；

(2)向大腸桿菌二中導入香豆酰輔酶A連接酶(4CL)，肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)，醇脫氫酶(ADH)的相應基因，體外添加肉桂酸，從發(fā)酵液中取樣，測OD并利用高效液相色譜對產物濃度進行分析。

(3)分別將產苯丙酸的菌株和產肉桂醇的菌株過夜培養(yǎng)之后，轉接合適的培養(yǎng)基中，在合適的溫度下培養(yǎng)一段時間，之后將兩種培養(yǎng)基混合進行混合培養(yǎng)。

進一步的，所述步驟(1)包括：

通過PCR方法從相應基因組獲得片段，使用限制性內切酶對片段和載體進行酶切，回收將酶切后的片段，之后將目的基因分別連接到高拷貝質粒pZE12-luc上，獲得pZE-TAL-ER重組質粒；

取構建好的質粒pZE-TAL-ER，通過化學轉化法轉入大腸桿菌中；之后取適量菌液涂到含有相應抗生素的平板上，37℃過夜培養(yǎng)；將轉化有質粒pZE-TAL-ER的大腸桿菌，定義菌株為EC1，在EC1的平板上挑取單菌落，在帶有相應抗性的液體LB中，過夜培養(yǎng)；之后將菌液轉接到20mL的帶有相應抗性培養(yǎng)基中，在溫度37℃條件下進行振蕩培養(yǎng)；當OD₆₀₀值為0.6時，加入IPTG進行誘導。

進一步的，所述步驟(2)包括：