[發明專利]一種大腸桿菌聯產苯丙酸與肉桂醇的方法

在審

• 申請號: 202111513297.8
• 申請日: 2021-12-12
• 公開（公告）號: CN116286563A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 孫婧
• 申請（專利權）人: 江蘇師范大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/60;C12N15/52;C12N15/70;C12N15/66;C12P7/40;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 徐州先卓知識產權代理事務所(普通合伙) 32555
• 代理人: 陳俊杰

1.一種大腸桿菌聯產苯丙酸與肉桂醇的方法，其特征在于，包括：

向一株大腸桿菌中導入導入酪氨酸解氨酶(TAL)、烯酸還原酶(ER)的相應基因，向另一株大腸桿菌中中導入香豆酰輔酶A連接酶(4CL)，肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)，醇脫氫酶(ADH)的相應基因，之后共培養兩株大腸桿菌獲得苯丙酸和肉桂醇。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，包括步驟：

(1)向大腸桿菌一中導入酪氨酸解氨酶(TAL)，烯酸還原酶(ER)的相應基因，從發酵液中取樣，利用高效液相色譜對產物濃度進行分析；

(2)向大腸桿菌二中導入香豆酰輔酶A連接酶(4CL)，肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)，醇脫氫酶(ADH)的相應基因，體外添加肉桂酸，從發酵液中取樣，測OD并利用高效液相色譜對產物濃度進行分析。

(3)分別將產苯丙酸的菌株和產肉桂醇的菌株過夜培養之后，轉接合適的培養基中，在合適的溫度下培養一段時間，之后將兩種培養基混合進行混合培養。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)包括：

通過PCR方法從相應基因組獲得片段，使用限制性內切酶對片段和載體進行酶切，回收將酶切后的片段，之后將目的基因分別連接到高拷貝質粒pZE12-luc上，獲得pZE-TAL-ER重組質粒；

取構建好的質粒pZE-TAL-ER，通過化學轉化法轉入大腸桿菌中；之后取適量菌液涂到含有相應抗生素的平板上，37℃過夜培養；將轉化有質粒pZE-TAL-ER的大腸桿菌，定義菌株為EC1，在EC1的平板上挑取單菌落，在帶有相應抗性的液體LB中，過夜培養；之后將菌液轉接到20mL的帶有相應抗性培養基中，在溫度37℃條件下進行振蕩培養；當OD₆₀₀值為0.6時，加入IPTG進行誘導。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)包括：

通過PCR方法從相應基因組獲得片段，使用限制性內切酶對片段和載體進行酶切，回收將酶切后的片段，之后將目的基因分別連接到高拷貝質粒pZE12-luc上，獲得pZE-4CL-CCR-ADH重組質粒；取構建好的質粒pZE-4CL-CCR-ADH，通過化學轉化法轉入大腸桿菌中；之后取適量菌液涂到含有相應抗生素的平板上，37℃過夜培養；將轉化有質粒pZE-TAL-ER的大腸桿菌，定義菌株為EC2，在EC2的平板上挑取單菌落，在帶有相應抗性的液體LB中，過夜培養；之后將菌液轉接到20mL的帶有相應抗性培養基中，在溫度37℃條件下進行振蕩培養；當OD₆₀₀值為0.6時，加入IPTG進行誘導。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)包括：

分別將產苯丙酸的菌株和產肉桂醇的菌株過夜培養之后，轉接合適的培養基中，在合適的溫度下培養一段時間，之后將兩種培養基混合培養。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)包括：

分別將產苯丙酸的菌株和產肉桂醇的菌株過夜培養之后，轉接合適的培養基中，在合適的溫度下培養36h，之后將兩種培養基混合培養至72h。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)包括：

分別將產苯丙酸的菌株和產肉桂醇的菌株過夜培養之后，轉接合適的培養基中，在合適的溫度下培養產苯丙酸的菌株36h，培養產肉桂醇的菌株24h，之后將兩種培養基混合培養至72h。