[發(fā)明專利]EGF間充質(zhì)干細胞外泌體的純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111509707.1
• 申請日: 2021-12-10
• 公開（公告）號: CN114134109B
• 公開（公告）日: 2023-01-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄒衡芳;周晗;姚基祥;林菁華
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州遠想生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 廣州廣典知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44365
• 代理人: 曾銀鳳

本發(fā)明涉及一種EGF間充質(zhì)干細胞外泌體的純化方法，包括如下步驟：步驟1：將含有EGF間充質(zhì)干細胞外泌體的細胞培養(yǎng)液離心，取上清液；步驟2：將步驟1中收集的上清液用切向流超濾系統(tǒng)過濾濃縮，得濃縮液；步驟3：將步驟2中的濃縮液用陰離子交換層析柱分離純化，收集洗脫峰溶液；步驟4：將步驟3中收集的洗脫峰溶液用肝素親和層析柱分離純化，收集洗脫峰溶液，即得所述EGF間充質(zhì)干細胞外泌體。該方法能夠特異性分離提純EGF間充質(zhì)干細胞外泌體，可有效分離攜帶EGF蛋白和未攜帶EGF蛋白的外泌體，提取的EGF間充質(zhì)干細胞外泌體與傳統(tǒng)超速離心方法相比，EGF蛋白含量更高，并且可以保持外泌體的完整性和生物學(xué)功能。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及外泌體提取分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種EGF間充質(zhì)干細胞外泌體的純化方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重大應(yīng)用前景，能夠用于包括肝，心臟，骨骼，軟骨，神經(jīng)和皮膚在內(nèi)的多種組織再生和治療。間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體是一種納米級的細胞外囊泡，屬于間充質(zhì)干細胞的旁分泌介質(zhì)之一。外泌體能夠?qū)y帶間充質(zhì)干細胞中的miRNA和mRNA分子、多肽、蛋白質(zhì)、細胞因子和脂質(zhì)等功能性物質(zhì)，可將這些內(nèi)容物遞送到受體細胞，發(fā)揮細胞通訊功能，調(diào)節(jié)受體細胞的生理功能，有助于受傷或患病組織和器官的愈合。在許多實驗?zāi)Ｐ椭卸加袌蟮篱g充質(zhì)干細胞的治療作用主要是由其分泌的外泌體發(fā)揮作用。因此，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可以用于治療各種疾病，例如：在皮膚傷口愈合中，其能夠促進血管生成，減少炎癥，促進皮膚細胞的增殖遷徙等。間充質(zhì)干細胞來源的外泌體與間充質(zhì)干細胞相比更穩(wěn)定，能夠減少給藥活細胞的安全風(fēng)險，例如具有低免疫原性，避免微血管阻塞風(fēng)險等。除了上述提及的作用外，外泌體作為一種納米級的脂質(zhì)雙分子囊泡還能夠被分離并在低溫條件下長期保存，不需要考慮成活率，體積微小容易循環(huán)，內(nèi)容物穩(wěn)定性較好。

生長因子EGF能刺激上皮細胞的增殖和遷移以及介導(dǎo)角質(zhì)形成細胞向上皮細胞的分化進而促進傷口發(fā)生上皮化重建上皮屏障，在創(chuàng)傷愈合的過程中具有重要的作用。間充質(zhì)干細胞來源的外泌體富含各種內(nèi)容物，也包括生長因子EGF，但其一般表達于外泌體的膜內(nèi)，EGF在外泌體中的含量較少，在受損部位中，外泌體攜帶的EGF雖然也能夠被遞送到受體細胞中發(fā)揮作用，但是由于是表達在膜內(nèi)，因此EGF不能發(fā)揮特異靶向性作用，并且含量較低，其生物活性作用不是很顯著。

CN113088496A公開了一種EGF間充質(zhì)干細胞外泌體，EGF間充質(zhì)干細胞外泌體是指通過基因工程改造后使間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體膜上錨定有EGF生長因子的外泌體。該EGF間充質(zhì)干細胞外泌體的EGF表達量得到很大提高，此外由于EGF被表達在外泌體的細胞膜的表面，將這類EGF間充質(zhì)干細胞外泌體遞送到損傷組織，作用于該部位的多種細胞，能針對受損部位的肌成纖維細胞、真皮成纖維細胞、上皮細胞、角質(zhì)形成細胞以及表皮細胞等發(fā)揮特異性靶向作用，促進細胞的增殖遷徙，從而能夠更好地促進損傷組織的愈合。

但是，目前針對EGF間充質(zhì)干細胞外泌體還沒有一種特異性的純化方法，導(dǎo)致EGF間充質(zhì)干細胞外泌體還無法得到大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，本發(fā)明的目的在于提供一種EGF間充質(zhì)干細胞外泌體的純化方法，該方法實現(xiàn)了EGF間充質(zhì)干細胞外泌體的特異性分離提純，提取的EGF間充質(zhì)干細胞外泌體與傳統(tǒng)超速離心方法相比，EGF蛋白含量更高。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種EGF間充質(zhì)干細胞外泌體的純化方法，包括如下步驟：

步驟1：將含有EGF間充質(zhì)干細胞外泌體的細胞培養(yǎng)液離心，取上清液；

步驟2：將步驟1中收集的上清液用切向流超濾系統(tǒng)過濾濃縮，得濃縮液；

步驟3：將步驟2中的濃縮液用陰離子交換層析柱分離純化，收集洗脫峰溶液；

步驟4：將步驟3中收集的洗脫峰溶液用肝素親和層析柱分離純化，收集洗脫峰溶液，即得所述EGF間充質(zhì)干細胞外泌體。