[發(fā)明專利]EGF間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的純化方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 202111509707.1 | 申請(qǐng)日： | 2021-12-10 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN114134109B | 公開（公告）日： | 2023-01-24 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 鄒衡芳;周晗;姚基祥;林菁華 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 廣州遠(yuǎn)想生物科技股份有限公司 |
| 主分類號(hào)： | C12N5/0775 | 分類號(hào)： | C12N5/0775 |
| 代理公司： | 廣州廣典知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44365 | 代理人： | 曾銀鳳 |
| 地址： | 510335 廣東省廣州市海珠*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | egf 間充質(zhì) 干細(xì)胞 外泌體 純化 方法 | ||
1.一種EGF間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的純化方法，其特征在于，包括如下步驟：
步驟1：將含有EGF間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的細(xì)胞培養(yǎng)液離心，取上清液；
步驟2：將步驟1中收集的上清液用切向流超濾系統(tǒng)過濾濃縮，得濃縮液；
步驟3：將步驟2中的濃縮液用陰離子交換層析柱分離純化，收集洗脫峰溶液；
步驟4：將步驟3中收集的洗脫峰溶液用肝素親和層析柱分離純化，收集洗脫峰溶液，即得所述EGF間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體；
所述EGF間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體是指通過基因工程改造后使間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體膜上錨定有EGF生長因子的外泌體；
步驟1所述離心包括：先通過低速離心去除細(xì)胞，再通過高速離心去除細(xì)胞碎片和大顆粒雜質(zhì)；所述低速離心的離心力為2500rpm~3500rpm，離心時(shí)間為20分鐘~40分鐘；所述高速離心的轉(zhuǎn)速為8000rpm~10000rpm，離心時(shí)間為20分鐘~40分鐘；
步驟2所述切向流超濾系統(tǒng)的超濾膜截留分子量為250KDa~350KDa；
步驟3所述陰離子交換層析柱中的層析介質(zhì)為：Q Bestarose Fast Flow；
步驟3所述用陰離子交換層析柱分離純化中使用的平衡液由如下濃度的組分組成：濃度為45mmol/L~55mmol/L 的Tris-HCl，濃度為0.08mol/L~0.12mol/L的NaCl，濃度為15mmol/L~25mmol/L的EDTA-2Na；步驟3所述用陰離子交換層析柱分離純化中使用的平衡液的pH為7.8~8.2；
步驟3所述用陰離子交換層析柱分離純化中使用的洗脫液由如下濃度的組分組成：濃度為45mmol/L~55mmol/L 的Tris-HCl，濃度為0.7mol/L~0.9mol/L的NaCl，濃度為15mmol/L~25mmol/L的EDTA-2Na；步驟3所述用陰離子交換層析柱分離純化中使用的洗脫液的pH為7.8~8.2；
步驟3所述用陰離子交換層析柱分離純化的上樣速度為1mL/min~2mL/min；所述用陰離子交換層析柱分離純化采用梯度洗脫的方式進(jìn)行洗脫，洗脫梯度為50%~100%，洗脫時(shí)間為20min~30min，洗脫流速為0.5~1.5ml/min；
步驟4所述肝素親和層析柱的層析介質(zhì)為Heparin Bestarose FF；
步驟4所述用肝素親和層析柱分離純化中使用的平衡液由如下濃度的組分組成：濃度為18mmol/L~22mmol/L的磷酸鹽緩沖液，濃度為0.5mol/L~0.7mol/L的NaCl，濃度為18mmol/L~22mmol/L的EDTA-2Na；步驟4所述用肝素親和層析柱分離純化中使用的平衡液的pH為6.0~6.2；
步驟4所述用肝素親和層析柱分離純化中使用的洗脫液由如下濃度的組分組成：濃度為18mmol/L~22mmol/L的磷酸鹽緩沖液，濃度為1.5~1.7mol/L的NaCl，濃度為18mmol/L~22mmol/L的EDTA-2Na。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的純化方法，其特征在于，步驟1所述離心包括：所述低速離心的轉(zhuǎn)速為2900rpm~3100rpm，離心時(shí)間為28分鐘~32分鐘；所述高速離心的轉(zhuǎn)速為8500rpm~9500rpm，離心時(shí)間為28分鐘~32分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的純化方法，其特征在于，所述低速離心的離心力為3000rpm，離心時(shí)間為30分鐘；所述高速離心的離心力為9000rpm，離心時(shí)間為30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的純化方法，其特征在于，步驟2所述切向流超濾系統(tǒng)的超濾膜截留分子量為300KDa。
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