[發明專利]一種自主構建的SLA-2-HB01-pCDH/sT2細胞系篩選CTL表位方法

在審

• 申請號: 202111508061.5
• 申請日: 2021-12-10
• 公開（公告）號: CN114181895A
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 高鳳山
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;G01N33/68
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙) 21235
• 代理人: 胡景波

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種自主構建的SLA?2?HB01?pCDH/sT2細胞系篩選CTL表位方法。本發明將外源的SLA?2?HB01基因轉染到sT2細胞，建立了穩定SLA?2基因表達模型。經過細胞表面負載EB155等陽性表位肽，通過FACs檢測細胞表面表達的SLA?2?peptides?β2m復合體，判定SLA?2?HB01?pCDH/sT2具有遞呈外源性多肽表位的功能。為了促進細胞表面復合體的形成，添加β2m有助于抗原多肽遞呈效率的提高。本發明結果中，As63、EB155和Hu62肽類均能夠被SLA?2?HB01??pCDH/sT2細胞系遞呈，其中As63在SLA?2?HB01?pCDH/sT2、SLA?2?HB01?Flag?pCDH/sT2和SLA?2?HB01?3×Flag?pCDH/在sT2細胞系中均被遞呈且遞呈效率基本一致，說明本發明構建的系列表達SLA?2?HB01基因的sT2具有遞呈抗原的功能，從而可以用以在細胞水平上篩選豬源病毒的多肽表位，也進一步證明了SLA?2重鏈分子C?末端添加Flag標簽不會影響細胞系的抗原遞呈功能。

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種自主構建的SLA-2-HB01-pCDH/sT2細胞系篩選CTL表位方法。

背景技術

傳統疫苗對豬源病毒，如口蹄疫病毒，難以控制并容易產生人畜共患病的現象，因此研制新型安全的疫苗是目前研究的重點之一。隨著免疫學與生物信息學不斷融合發展，利用病毒抗原預測SLA-2限制性CD8⁺CTL表位，進而構建多肽表位疫苗是研究熱點。所以如何選擇合適的病毒抗原表位是重中之重。

表位(epitope)也稱抗原表位，抗原決定簇，抗原分子中決定抗原特異性的化學基團，能與TCR或BCR特異性結合的基本單位，最終激起機體的免疫反應形成對病原微生物的免疫能力。表位通常包括B細胞表位、Th表位和CTL表位。其中，在宿主細胞內CTL表位與感染病毒的免疫應答直接相關，激發的殺傷性T細胞免疫預防效果最顯著，因此也成為當今病毒表位研究的熱點。

CTL表位是抗原蛋白與MHC I類分子結合并被TCR特異性識別，誘導CD8⁺CTL產生免疫反應的短肽。T細胞表位由MHC I類分子遞呈到細胞表面，被TCR識別形成三分子復合體，激活相應的CD8⁺T細胞轉化為致敏性CTL發揮細胞毒性作用殺傷靶細胞。

目前，篩選CTL表位的技術有很多，常用的方法有：

MHC四聚體(MHC tetramer)技術：Altman等人借助生物素(biotin)-親和素(avidin)級聯放大反應原理提出的。該技術根據生物素與親和素4:1的特異性結合關系，利用生物素-蛋白連接酶(Biotin-protein ligaseA,BirA)能識別蛋白的特異序列，在MHC分子α鏈N端加入1個識別生物素的BirA酶底物肽序列，BirA酶可催化生物素結合到pMHC上，4個純化的pMHC單體與1個親和素標記的鏈霉素形成四聚體復合物，從而提高pMHC與TCR的親和力，并通過靈敏度較高的FACs對抗原特異性T淋巴細胞進行快速的檢測和分離。

噬菌體展示技術(phage display technique,PDT)：用于篩選和改造抗原多肽的技術，將外源性蛋白或抗體可變區與噬菌體表面特定蛋白融合，構建蛋白庫并篩選親和性較高的特異性蛋白的基因工程技術。此技術庫容量大，但特異性和敏感性較低，不能實現全蛋白分子的表達。該方法只能進行B細胞表位和Th表位的篩選，而不能進行CTL表位篩選。

體外構建重鏈和輕鏈復合物篩選：在體外模擬多肽表位與MHC I類分子α鏈分子在體內的結合方式也可以實現限制性多肽表位與MHC I類分子的體外結合。這種結合有兩種方式：一種是多肽表位與單表達MHC I類分子α鏈和β2m鏈結合；第二種是多肽表位與MHC I類分子復合物結合。