[發明專利]一種自主構建的SLA-2-HB01-pCDH/sT2細胞系篩選CTL表位方法

在審

• 申請號: 202111508061.5
• 申請日: 2021-12-10
• 公開（公告）號: CN114181895A
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 高鳳山
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;G01N33/68
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙) 21235
• 代理人: 胡景波

1.一種自主構建的SLA-2-HB01-pCDH/sT2細胞系篩選CTL表位方法，其特征是，包括以下步驟：

步驟S1：多肽表位合成；其中，多肽序列如下：

步驟S2：PK15、sT2和SLA-2-HB01-pCDH/sT2細胞系親和力實驗；

步驟S3：篩選肽類條件；

步驟S4：CTL表位篩選；

步驟S5：激光共聚焦檢測。

2.如權利要求1所述的一種自主構建的SLA-2-HB01-pCDH/sT2細胞系篩選CTL表位方法，其特征是，所述步驟S2具體步驟為：

(1)選取狀態較好的PK15、sT2和SLA-2-HB01-pCDH/sT2細胞，分別給3種細胞計數，均為4×10⁶個細胞，于37℃、5％的CO₂培養箱中培養12h后，分別給細胞負載EB155肽類，濃度為50ug/mL，培養16h，同時設置對照組；

(2)孵育細胞后，從培養箱中取出細胞，預冷1×PBS洗滌2-3次，消化收集細胞，計數后取1×10⁶個細胞；

(3)4％多聚甲醛，室溫固定20min，預冷1×PBS洗2次，然后用0.22μm微膜過濾的3％BSA室溫封閉10min，1×PBS沖洗2次；

(4)向3個細胞中加入200μL 1:500倍1×PBS稀釋的β2m單克隆抗體，4℃孵育1h，冷的1×PBS沖洗2-3次，除去未結合的特殊抗體；

(5)加入200μL 1:500倍1×PBS稀釋的PE Rat anti-Mouse IgG溶液，室溫下避光孵育1h，預冷1×PBS洗2次，加500μL 1×PBS重懸，過濾后用流式細胞儀進行檢測。

3.如權利要求1所述的一種自主構建的SLA-2-HB01-pCDH/sT2細胞系篩選CTL表位方法，其特征是，所述步驟S3具體步驟為：

(1)外源性肽類添加條件選擇

①選取狀態較好的sT2和SLA-2-HB01-pCDH/sT2細胞系，計數后接4×10⁶個細胞，sT2細胞一板，SLA-2-HB01-pCDH/sT2細胞四板，于37℃、5％的CO₂培養箱中培養12h后，分別進行不同處理：sT2細胞未處理；SLA-2-HB01-pCDH/sT2未處理；SLA-2-HB01-pCDH/sT2加入3μg/mLβ2m；SLA-2-HB01-pCDH/sT2加入50μg/mL AS63；SLA-2-HB01-pCDH/sT2加入3μg/mLβ2m和50μg/mL AS63于37℃、5％的CO₂培養箱中培養16h；

②孵育細胞后，從培養箱中取出細胞，預冷1×PBS洗滌2-3次，消化收集細胞，計數后取1×10⁶個細胞；

③4％多聚甲醛，室溫固定20min，預冷1×PBS洗2次，然后用0.22微膜過濾的3％BSA室溫封閉10min，1×PBS沖洗2次；

④向細胞中加入200μL 1:500倍1×PBS稀釋的β2m單克隆抗體，4℃孵育1h，冷的1×PBS沖洗2-3次，除去未結合的特殊抗體；

⑤加入200μL 1:500倍1×PBS稀釋的PE Rat anti-Mouse IgG溶液，室溫下避光孵育1h，預冷1×PBS洗2次，加500μL 1×PBS重懸，過濾后用流式細胞儀進行檢測；

(2)篩選肽類時間選擇

在前期實驗基礎上，選取狀態較好的sT2和SLA-2-HB01-pCDH/sT2細胞系，計數后接4×10⁶個細胞，sT2細胞一板，SLA-2-HB01-pCDH/sT2細胞6板，于37℃、5％CO₂培養箱中培養12h后，分別在5板SLA-2-HB01-pCDH/sT2細胞中負載50μg/mL AS63和3μg/mL β2m，然后于37℃、5％的CO₂培養箱中培養3h、6h、12h、16h、18h；細胞孵育后，處理方法同步驟S2(1)中方法一樣，進行流式檢測；

(3)已轉染sT2細胞系中肽類篩選

在前期實驗基礎上，選取狀態較好的sT2、SLA-2-HB01-pCDH/sT2、SLA-2-HB01-Flag-pCDH/sT2和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH/sT2細胞系，分別接種4×10⁶個細胞培養后，分別加入50μg/mL AS63和3μg/mL β2m，然后于37℃、5％的CO₂培養箱中培養18h，細胞孵育后，處理方法同步驟S2(1)中方法一樣，進行流式檢測。