[發(fā)明專利]一種尿液中外泌體的富集方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202111505906.5
• 申請日: 2021-12-10
• 公開（公告）號: CN114199665A
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李嘉欣;宋雷;任麗;馬聰聰;原續(xù)波;趙瑾;陳亮宇;李捷
• 申請（專利權(quán)）人: 譜天（天津）生物科技有限公司
• 主分類號: G01N1/40
• 分類號: G01N1/40;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/72;G01N15/02
• 代理公司: 南京中律知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32341
• 代理人: 祝坤

本發(fā)明公開了一種尿液中外泌體的富集方法，包括向待測尿液樣本中加入結(jié)合緩沖液及硅鋁酸鹽材料，得到混懸液；將所述混懸液孵育后，進(jìn)行高速離心，去除上清液，保留沉淀Ⅰ；采用清洗緩沖液重懸所述沉淀Ⅰ重懸得到重懸液，將所述重懸液高速離心后去除上清，保留沉淀Ⅱ，重復(fù)該步驟數(shù)次，最后得到包含外泌體的沉淀。本發(fā)明采用硅鋁酸鹽材料及相應(yīng)結(jié)合緩沖液，可有效富集尿液中外泌體；并且采用在線酶解的方式，可直接對所富集的外泌體蛋白質(zhì)組進(jìn)行后續(xù)的檢測分析。本發(fā)明方法操作簡單，富集速度快，只需要通過孵育?離心?洗滌?離心4個步驟就可完成尿液中外泌體的富集，提高檢測靈敏度的同時減少人為操作誤差。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種尿液中外泌體的富集方法。

背景技術(shù)

外泌體是由多種細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞分泌的、直徑為30～150nm、具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡。因其特殊的分泌方式，外泌體攜帶了其來源細(xì)胞的生物信息，包括蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等，在腫瘤微環(huán)境的形成、血管生成、炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫、微轉(zhuǎn)移等過程中起著至關(guān)重要的作用。外泌體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可自由通過各種生理屏障，并廣泛分布于血液、尿液等體液中。尿液相對其他體液具有取樣簡單、保存方便、侵入性更低等特點(diǎn)，同時含有大量外泌體等細(xì)胞外囊泡(EVs)，在疾病診療等臨床領(lǐng)域意義重大，特別是對于患有腎臟疾病的患者，尿液外泌體提供的信息可直接反應(yīng)腎臟的生理狀態(tài)，既可能作為腎臟疾病的新型分子標(biāo)志物，也可能為腎臟疾病的治療提供治療靶標(biāo)或發(fā)揮潛在治療作用。

目前外泌體的分離常采用超速離心法、密度梯度離心法、體積排除色譜法、聚合物沉淀法和免疫親和法等，這些方法存在分離時間長、操作繁瑣、成本高、分離效率低下等問題，開發(fā)快速、高效的外泌體富集方法是實(shí)現(xiàn)尿液中外泌體蛋白質(zhì)研究的首要任務(wù)。鋁硅酸鹽材料如云母、高嶺土、沸石等，其具有天然的孔道結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的選擇性，特別是多孔性沸石材料，由硅氧四面體或鋁氧四面體通過氧橋鍵相連而形成，具有分子尺寸大小(通常為0.3～2.0nm)的孔道和空腔體系、穩(wěn)定的骨架結(jié)構(gòu)、以及高的比表面積等，在氣體的吸附分離、離子交換以及石油催化裂化等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。但是目前沒有利用該類材料富集尿液中外泌體方面的探索研究。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：針對目前尿液中外泌體富集方法的局限性，本發(fā)明提供了一種尿液中外泌體的富集方法，其中使用硅鋁酸鹽材料和相應(yīng)的結(jié)合緩沖液，能夠從尿液中富集外泌體，并且采用在線酶解的方式，可直接對所富集的外泌體蛋白質(zhì)組進(jìn)行后續(xù)的檢測分析；有效提高了尿液中蛋白質(zhì)及肽段組的鑒定數(shù)目。

技術(shù)方案：為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種尿液中外泌體的富集方法，包括如下步驟：

S1、將尿液進(jìn)行低速離心，保留上清液為待測尿液樣本；

S2、向待測尿液樣本中加入結(jié)合緩沖液及硅鋁酸鹽材料，得到混懸液；

S3、將所述混懸液孵育后，進(jìn)行高速離心，去除上清液，保留沉淀Ⅰ；

S4、采用清洗緩沖液重懸所述沉淀Ⅰ重懸得到重懸液，將所述重懸液高速離心后去除上清，保留沉淀Ⅱ，重復(fù)該步驟數(shù)次，最后得到包含外泌體的沉淀。

優(yōu)選的，步驟S1中，所述低速離心的條件如下：離心力為200～10,000g，溫度為2～26℃，時間為1～60分鐘。

優(yōu)選的，步驟S2中，所述結(jié)合緩沖液成分包括Tris、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鉀、磷酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉、氯化鉀、氯化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、巴比妥酸、巴比妥鈉、氫氧化鈉、鹽酸、EDTA、SDS、NP-40、CHAPS、吐溫、Triton、PEG、乙腈、甲醇中的一種或任意組合。