[發明專利]唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP恒溫快速檢測方法有效
| 申請號： | 202111502774.0 | 申請日： | 2021-12-10 |
| 公開（公告）號： | CN114182030B | 公開（公告）日： | 2022-09-16 |
| 發明（設計）人： | 肖劍;梁美丹;宋安華;孫雪奇;戚平;雷燕;曹霞飛;胡雯艷;黃鐵城;葉春嫦 | 申請（專利權）人： | 廣州市食品檢驗所（廣州市酒類檢測中心） |
| 主分類號： | C12Q1/689 | 分類號： | C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/01 |
| 代理公司： | 廣州市一新專利商標事務所有限公司 44220 | 代理人： | 周佳 |
| 地址： | 511405 廣東省*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 唐菖蒲 霍爾 德氏菌 lamp 恒溫 快速 檢測 方法 | ||
1.唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP恒溫快速檢測方法，其特征在于包括有以下步驟：
步驟1、準備待測DNA樣品，以及準備對待測DNA樣品進行LAMP恒溫擴增的LAMP恒溫擴增特異性引物；
所述待測DNA樣品經超微量分光光度計測定后，其A260/A280在1.7-2.0之間，DNA濃度＞10ng/μL，于-20℃保存備用；
所述LAMP恒溫擴增特異性引物是選取唐菖蒲伯克霍爾德氏菌特異性基因序列進行合成得到，所述唐菖蒲伯克霍爾德氏菌基因采用：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(Burkholderiagladioli pv.cocovenerans)水解酶cayF基因；所述特異性基因序列在唐菖蒲伯克霍爾德氏菌水解酶cayF基因中第195bp-389bp位置；
所述LAMP恒溫擴增特異性引物為：
外引物F3：5’-CACCTTCCGCAAGACGC-3’
外引物B3：5’-CGAAAACCCGCCTTCTGC-3’
內引物FIB：5’-AGATGGCCGTGGGTGACGCCGCCCAAGGACATGTCGC-3’
內引物BIP：5’-CACCGTGCTGCTGGTGCACGCTTGGGCACGAAGGAGA-3’
環引物LF：5’-ACGCCGCGGATCTCGAA-3’
環引物LB：5’-CGACAGCGCCACCATGT-3’
步驟2、采用LAMP恒溫擴增反應體系，對待測DNA樣品進行LAMP恒溫擴增，采用實時熒光PCR儀檢測擴增產物的熒光信號，得到檢測結果；其中，所述LAMP恒溫擴增反應體系包括有所述LAMP恒溫擴增特異性引物。
2.根據權利要求1所述的唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP恒溫快速檢測方法，其特征在于：所述LAMP恒溫擴增反應體系為25μL，包括有內引物FIB 100μmol/L和內引物BIP 100μmol/L各0.4μL，外引物F3 100μmol/L和外引物B3 100μmol/L各0.05μL，環引物LF 100μmol/L和環引物LB 100μmol/L各0.2μL；其余試劑組分分別為：10×Thermo pol Buffer 2.5μL，MgSO4100mmol/L 1μL，dNTPs 10mmol/L 3μL，甜菜堿5mol/L 5μL，Bst酶8U/μL 1μL，熒光染料0.5μL，DNA模板2μL，ddH2O 8.7μL。
3.根據權利要求2所述的唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP恒溫快速檢測方法，其特征在于：所述LAMP恒溫擴增反應體系中，采用恒溫擴增儀的LAMP恒溫擴增條件為：擴增溫度是63℃，進行45個循環，每個循環的擴增時間是60s；采用實時熒光PCR儀的擴增條件為：第一步63℃條件下擴增30s，1個循環，不采集熒光信號；第二步63℃條件下擴增15s，45個循環，不采集熒光信號；第三步63℃條件下擴增45s，45個循環，采集熒光信號。
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