[發明專利]唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP恒溫快速檢測方法

有效

• 申請號: 202111502774.0
• 申請日: 2021-12-10
• 公開（公告）號: CN114182030B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發明（設計）人: 肖劍;梁美丹;宋安華;孫雪奇;戚平;雷燕;曹霞飛;胡雯艷;黃鐵城;葉春嫦
• 申請（專利權）人: 廣州市食品檢驗所（廣州市酒類檢測中心）
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市一新專利商標事務所有限公司 44220
• 代理人: 周佳

本發明提出唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP恒溫快速檢測方法，步驟有：1、準備待測DNA樣品及LAMP恒溫擴增特異性引物；其中LAMP恒溫擴增特異性引物是選取唐菖蒲伯克霍爾德氏菌特異性基因序列進行合成得到，該基因采用唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)水解酶cayF基因；所述LAMP恒溫擴增特異性引物為：外引物F3、外引物B3、內引物FIB、內引物BIP、環引物LF、環引物LB；2、采用LAMP恒溫擴增反應體系對待測DNA樣品進行LAMP恒溫擴增，檢測擴增產物的熒光信號，得到檢測結果。本發明對唐菖蒲伯克霍爾德氏菌特異性好、靈敏度高，可用于食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的快速檢測。

技術領域

本發明屬于分子生物技術領域，具體是涉及一種用于檢測食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP恒溫擴增方法。

背景技術

椰毒假單胞菌酵米面亞種(Pseudomona cocovenenans)是1977年在東北酵米面中毒食品中發現的新的食品中毒菌，在2003年被劃分為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(Burkholderia gladioli)的一個病原型。谷類發酵制品(發酵玉米面、糯玉米湯圓粉、玉米淀粉、發酵糯小米、醋涼粉等)，變質銀耳，薯類制品(馬鈴薯粉條、甘薯淀粉、山芋淀粉等)容易受到該菌的污染。唐菖蒲伯克霍爾德氏菌可產生毒黃素和米酵菌酸，能引起高致病性的食物中毒。由該菌產生的米酵菌酸毒素引發的食物中毒事件在我國部分地區常有發生。據不完全統計，我國多個省都曾出現由該菌引起的食品中毒案例。1975年，我國東北三省因酵米面中毒226起，平均死亡率38.1％；1990～2006年廣西因酵米面中毒121人，死亡率高達62.81％；2012年和2014年云南省紅河州和文山州發生的兩起居民食用變質玉米面湯圓和吊漿粑導致中毒死亡；2018年廣東省河源市和東莞市也接連發生了因食用河粉引起中毒事件。

目前對唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)的檢測主要采用傳統生理生化和免疫學方法，例如國標方法(GB 4789.29-2020)檢測包括增菌、分離純化、生化鑒定、血清鑒定、毒理試驗，檢測操作步驟繁瑣、耗費時間長，檢測效率低，在重大食品安全保障任務或突發食品中毒事件中，傳統的檢測方法難以滿足對食品的安全性提供及時準確的判斷要求。LAMP檢測技術，全稱為環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)主要是利用具有鏈置換特異性的Bst DNA聚合酶和4～6條能夠特異性識別靶標序列上多個特異性區域的引物，開啟循環鏈置換反應，從而實現等溫條件下的連續快速反應。該技術具有特異性強、靈敏度高、檢測成本低、所需設備及人員要求不高，操作簡單，反應時間短等優點。

綜上，非常有必要建立一套特異性好、靈敏度高的食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP恒溫擴增方法，應用于食品安全監督檢驗、保障性檢驗及突發食品安全事件應急檢驗等領域。

發明內容

本發明的目的是提出一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP恒溫快速檢測方法，其對唐菖蒲伯克霍爾德氏菌特異性好、靈敏度高，可用于食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的快速檢測。

本發明的目的可通過以下技術方案實現：

唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP恒溫快速檢測方法，其包括有以下步驟：

步驟1、準備待測DNA樣品，以及準備對待測DNA樣品進行LAMP恒溫擴增的LAMP恒溫擴增特異性引物；

所述待測DNA樣品經超微量分光光度計測定后，其A260/A280在1.7-2.0之間，DNA濃度＞10ng/μL，于-20℃保存備用；

所述LAMP恒溫擴增特異性引物是選取唐菖蒲伯克霍爾德氏菌特異性基因序列進行合成得到，所述唐菖蒲伯克霍爾德氏菌基因采用：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(Burkholderiagladioli pv.cocovenerans)水解酶cayF基因；所述特異性基因序列在唐菖蒲伯克霍爾德氏菌水解酶cayF基因中第195bp-389bp位置。