[發明專利]一種細菌漆酶變構體及其制備方法

在審

• 申請號: 202111496402.1
• 申請日: 2021-12-09
• 公開（公告）號: CN113999826A
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發明（設計）人: 蘭善紅;劉金環;胡俊杰;呂小梅
• 申請（專利權）人: 東莞理工學院
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 廣州高炬知識產權代理有限公司 44376
• 代理人: 景梅

1.一種細菌漆酶變構體，其特征在于：所述細菌漆酶變構體的氨基酸序列相較于SEQID NO.1所示的野生型細菌漆酶的氨基酸序列存在至少一個缺失片段；所述缺失片段被移除后，不改變由His443，Cys500和His505所形成的Cu1的空間結構。

2.根據權利要求1所述的細菌漆酶變構體，其特征在于：所述的缺失片段為野生型細菌漆酶序列中形成R-loop結構或MR螺旋的氨基酸序列。

3.根據權利要求1所述的細菌漆酶變構體，其特征在于：所述缺失片段的位置為SEQ IDNO.1所示的野生型細菌漆酶的氨基酸序列的61-68、128-140、198-206、256-264、313-322或373-385號位中的任意一個位點。

4.根據權利要求1所述的細菌漆酶變構體，其特征在于：所述細菌漆酶變構體的氨基酸序列為SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.9所示序列的任意一種。

5.一種編碼如權利要求1-4任一項所述的細菌漆酶變構體的核酸序列。

6.根據權利要求5所述的核酸序列，其特征在于：所述的核酸序列為SEQ ID NO.11-SEQID NO.18所示序列的任意一種。

7.一種工程菌，其特征在于：所述的工程菌中含有權利要求5中所述的核酸序列。

8.一種工程菌，其特征在于：所述的工程菌中含有權利要求1-4任一項所述的細菌漆酶變構體。

9.一種如權利要求1-4任一項所述的細菌漆酶變構體的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟1、獲取序列：以大腸桿菌來源的漆酶CueO的晶體結構為原型，通過AutodockVina、RosettaFold、PyMOL、Procheck軟件進行蛋白質輔助設計，得到細菌漆酶變構體、序列結構與基因序列；

步驟2、合成漆酶基因：根據宿主菌株的密碼子偏愛，合成得到含偏愛密碼子優化的細菌漆酶變構體的基因的克隆載體質粒pUC-GW-Kan及其宿主菌株；

步驟3、提取漆酶基因模板：對含克隆載體質粒的宿主菌株進行培養、收集，提取質粒，得到含細菌漆酶變構體的基因模板的載體pUC-GW-Kan；

步驟4、構建重組載體：通過酶切連接法將細菌漆酶變構體的基因與pET28a+質粒連接構建重組載體，得到重組載體；

步驟5、構建重組菌株：將重組載體轉化至大腸桿菌感受態細胞中，得到重組菌株；

步驟6、誘導培養：用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG誘導培養重組菌株，并加入硫酸銅進一步培養誘導培養，并提取蛋白；

步驟7、漆酶活性的測定：使用ABTS法測定漆酶活性。

10.根據權利要求9所述的細菌漆酶變構體的制備方法，其特征在于：步驟5所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21 DE3菌株。