[發(fā)明專利]一種細(xì)菌漆酶變構(gòu)體及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111496402.1
• 申請(qǐng)日: 2021-12-09
• 公開（公告）號(hào): CN113999826A
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘭善紅;劉金環(huán);胡俊杰;呂小梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東莞理工學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 廣州高炬知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44376
• 代理人: 景梅

本發(fā)明公開了一種細(xì)菌漆酶變構(gòu)體及其制備方法，其中還公開了相應(yīng)核酸序列以及包含有該序列的工程菌；本發(fā)明通過(guò)在特定的序列位點(diǎn)進(jìn)行刪除相應(yīng)序列或缺失片段，更為具體的為刪除了序列中形成MR螺旋和R?loop結(jié)構(gòu)的序列，使得所獲得的細(xì)菌漆酶的變構(gòu)體酶活性增強(qiáng)和表達(dá)量的有效提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程和酶工程領(lǐng)域，尤其涉及高表達(dá)量的細(xì)菌漆酶變構(gòu)體及其制備方法。

背景技術(shù)

漆酶，一種含多個(gè)銅離子的多酚氧化酶，主要以單體糖蛋白的形式存在。漆酶有著廣泛的催化底物譜，能夠催化氧化酚類和芳香族化合物，發(fā)生反應(yīng)后唯一的產(chǎn)物就是水，因此本質(zhì)上是一種環(huán)保催化劑。此外，還能和其他酶協(xié)同催化，是最具有潛力的工業(yè)酶制劑。漆酶可以用于食品加工、紙漿漂白和綠色合成等工業(yè)領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。在自然界中，漆酶的來(lái)源廣泛，在真菌、細(xì)菌、植物和動(dòng)物中都發(fā)現(xiàn)了漆酶，不同物種來(lái)源的漆酶功能相似。其中，細(xì)菌來(lái)源的漆酶相對(duì)于其他漆酶，具有生長(zhǎng)周期短、熱穩(wěn)定性好且pH范圍寬等優(yōu)勢(shì)，更適合大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。然而，目前有關(guān)提高細(xì)菌來(lái)源漆酶活性和表達(dá)量的方法甚少，因此，對(duì)提高細(xì)菌漆酶活性和表達(dá)量的研究具有重要研究意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。定向改造策略是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行多輪積累、連續(xù)突變、表達(dá)、篩選，從而引導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)朝人們需要的方向進(jìn)行的手段。它是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)改造手段，但其篩選時(shí)間長(zhǎng)、工作量大、且突變隨機(jī)不可預(yù)測(cè)，影響蛋白質(zhì)改造效率。隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)和計(jì)算生物學(xué)的快速發(fā)展，計(jì)算機(jī)模擬輔助酶改造通過(guò)分析蛋白序列、結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，預(yù)測(cè)基因改造范圍與位點(diǎn)，可顯著增加有效變構(gòu)體的比例，大大縮短實(shí)驗(yàn)周期。許多研究表明，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助的理性設(shè)計(jì)，酶分子改造能夠顯著提高酶的催化特性，并能夠顯著降低建立、篩選變構(gòu)體文庫(kù)所需的工作量。

然而，定點(diǎn)改造技術(shù)只集中在對(duì)蛋白質(zhì)分子的小范圍改造，特別是點(diǎn)突變。隨著對(duì)蛋白質(zhì)折疊以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)的深入，人們不斷探索通過(guò)對(duì)蛋白酶結(jié)構(gòu)域基因進(jìn)行改造，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)域改造后酶的酶活、表達(dá)量以及其他特性均有顯著改善。目前，計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)改在漆酶結(jié)構(gòu)域基因主要針對(duì)脫氫酶、纖維素酶、甘露聚糖酶等，目前仍鮮有通過(guò)基因結(jié)構(gòu)域優(yōu)化改造提升漆酶活性和表達(dá)量的專利報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種細(xì)菌漆酶變構(gòu)體、相關(guān)序列、工程菌及其制備方法。

本發(fā)明是通過(guò)以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

一種細(xì)菌漆酶變構(gòu)體，所述細(xì)菌漆酶變構(gòu)體的氨基酸序列相較于SEQ ID NO.1所示的野生型細(xì)菌漆酶的氨基酸序列存在至少一個(gè)缺失片段；所述缺失片段被移除后，不改變由His443，Cys500和His505所形成的Cu1的空間結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選地，所述的缺失片段為野生型細(xì)菌漆酶中的形成R-loop結(jié)構(gòu)或MR螺旋的氨基酸序列。

優(yōu)選地，所述缺失片段的位置為SEQ ID NO.1所示的野生型細(xì)菌漆酶的氨基酸序列的61-68、128-140、198-206、256-264、313-322或373-385號(hào)位中的任意一個(gè)位點(diǎn)。

優(yōu)選地，所述細(xì)菌漆酶變構(gòu)體的氨基酸序列為SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.9所示序列的任意一種。

本發(fā)明還提供了一種編碼前述的細(xì)菌漆酶變構(gòu)體的核酸序列。

優(yōu)選地，所述的核酸序列為SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.18所示序列的任意一種。

本發(fā)明還提供了一種工程菌所述的工程菌中含有前述述的核酸序列和/或包含有所述的細(xì)菌漆酶變構(gòu)體。

本發(fā)明還提供了一種細(xì)菌漆酶變構(gòu)體的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、獲取序列：以大腸桿菌來(lái)源的漆酶CueO的晶體結(jié)構(gòu)為原型，通過(guò)AutodockVina、RosettaFold、PyMOL、Procheck軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)輔助設(shè)計(jì)，得到細(xì)菌漆酶變構(gòu)體、序列結(jié)構(gòu)與基因序列；