[發(fā)明專利]檢測(cè)魚肉新鮮度的膠體金免疫層析試紙條及其制備和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111488784.3
• 申請(qǐng)日: 2021-12-07
• 公開（公告）號(hào): CN114217072A
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊方;陳紅;吳儀;王淑芬;姜啟興;許艷順;于沛沛;夏文水;余達(dá)威;高沛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/577;G01N33/558;G01N33/58;G01N33/543;G01N33/52
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 夏蘇娟

1.一種檢測(cè)魚肉新鮮度的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，包括底板、檢測(cè)墊、金標(biāo)墊、樣品墊和吸水墊；所述檢測(cè)墊設(shè)置于所述底板的中部，檢測(cè)墊上設(shè)有T線和C線，所述T線噴涂小清蛋白，所述C線噴涂羊抗鼠多克隆抗體；所述樣品墊設(shè)置于底板上靠近所述檢測(cè)墊T線的一側(cè)，所述金標(biāo)墊交疊設(shè)置于樣品墊與檢測(cè)墊之間，金標(biāo)墊上噴涂有膠體金標(biāo)記的小清蛋白單克隆抗體；所述吸水墊設(shè)置于底板上靠近所述檢測(cè)墊C線的一側(cè)并部分交疊于檢測(cè)墊上。

2.一種檢測(cè)魚肉新鮮度的膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，包括以下步驟，

S1：提取純化魚肉小清蛋白；

S2：將所述小清蛋白和羊抗鼠多克隆抗體噴涂在檢測(cè)墊基材上分別形成T線和C線，烘干得到檢測(cè)墊；

S3：將樣品墊、吸水墊和所述檢測(cè)墊組裝到底板上，切割，得到寬度為3-4mm的試紙條；

S4：采用膠體金標(biāo)記小清蛋白單克隆抗體，得到金標(biāo)抗體，將所述金標(biāo)抗體噴涂在活化金標(biāo)墊上，得到金標(biāo)墊；

將所述金標(biāo)墊組裝到所述試紙條中，得到所述膠體金免疫層析試紙條。

3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S1的具體步驟如下，

S1.1：將魚肉充分?jǐn)囁楹蠹尤刖彌_液I，均質(zhì)后離心，得到上清液A；

S1.2：對(duì)所述上清液A進(jìn)行加熱處理后離心，得到上清液B；

S1.3：將所述上清液B經(jīng)鹽析后分離，得到沉淀物；

S1.4：取所述沉淀物溶于緩沖液II中，4℃透析過夜；

S1.5：將透析好的液體經(jīng)微孔濾膜過濾，上樣于離子交換柱，用洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，流速為1mL/min，收集各組分并測(cè)定其在220nm、280nm出的紫外吸收值并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，確定魚肉小清蛋白所在組分，完成魚肉小清蛋白的提取純化。

4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S2中，將所述小清蛋白經(jīng)PB溶解至濃度為0.5-1.5mg/mL噴涂T線，噴涂量為1μL/cm；將羊抗鼠多克隆抗體經(jīng)PB稀釋至濃度為1.0-2.0mg/mL噴涂C線，噴涂量為1μL/cm。

5.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S3中，樣品墊由未活化的樣品墊在樣品處理液中浸泡后烘干得到；所述樣品處理液為含有表面活性物質(zhì)、糖類和大分子的緩沖溶液。

6.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S4中，活化金標(biāo)墊由未活化金標(biāo)墊在金標(biāo)墊處理液中浸泡并烘干；所述金標(biāo)墊處理液為含有表面活性物質(zhì)、糖類和大分子的緩沖溶液。

7.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S4中，金標(biāo)抗體的制備方法如下：

SS1：向氯金酸溶液中加入還原劑，加熱反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH至5.0-9.0，得到膠體金溶液；

SS2：向所述膠體金溶液中加入小清蛋白單克隆抗體，混勻后靜置；加入BSA溶液，混勻后靜置；加入PEG20000溶液，混勻后靜置；得到混合液；

SS3：分離所述混合液，得到沉淀，重懸，得到所述金標(biāo)抗體。

8.如權(quán)利要求2或7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S4中，膠體金標(biāo)記小清蛋白單克隆抗體的標(biāo)記量為18-30μg/mL，金標(biāo)抗體的的噴涂量為6-8μL。

9.如權(quán)利要求1所述的膠體金免疫層析試紙條用于檢測(cè)魚肉新鮮度的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟，將魚肉滲出汁液或提取的肌漿蛋白稀釋后，滴于樣品墊上，室溫條件下側(cè)向?qū)游?0-15min，待顯色穩(wěn)定后測(cè)定T/C值，根據(jù)T/C值判斷魚肉新鮮度。

10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述肌漿蛋白的提取方法為，魚肉充分?jǐn)囁楹蠹尤刖彌_液III，均質(zhì)1-2min，4℃靜置，冷凍離心取上清。