[發明專利]一種低鹽濃度肝素鈉與活性腸蛋白肽分離聯產工藝

有效

• 申請號: 202111488692.5
• 申請日: 2021-12-07
• 公開（公告）號: CN113999330B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 陳佳彤;陳講一;余璞斐;黃帥;徐袁
• 申請（專利權）人: 潢川縣鵬升畜產品有限公司
• 主分類號: C08B37/10
• 分類號: C08B37/10;C12P21/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/22
• 代理公司: 鄭州大豫知識產權代理事務所(普通合伙) 41214
• 代理人: 靳鵬超

1.一種低鹽濃度肝素鈉與活性腸蛋白肽分離聯產工藝，其特征在于，包括以下工藝步驟：以新鮮豬小腸為原料，經刮腸機將腸衣剝離得腸粘膜，加入抗氧化劑對粘膜蛋白進行保護，經低鹽度酶解、樹脂吸附、梯度鹽度洗脫、醇沉、干燥、粉碎操作，實現粗品肝素鈉與活性腸蛋白聯產；

包括以下工藝步驟：

S1、腸粘膜提取：取新鮮的豬小腸100根，使用刮腸機剝離腸衣，得到腸粘膜，同時用純化水沖洗，收集腸粘膜混合液228L，向腸粘膜破碎液中加入抗氧化劑亞硫酸氫鈉342g對腸蛋白進行抗氧化保護；

S2、低鹽度酶解：將步驟S1中得到的腸粘膜混合液用泵打入酶解罐，加入6mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值范圍至6.8，加熱攪拌，控制溫度至48℃，加入諾維信中性復合型蛋白水解酶160g，攪拌酶解4.5h；加入氫氧化鈉溶液調節pH值范圍至8.0，同時升高料液溫度至87℃，繼續攪拌3h；向料液中加入濃鹽酸回調pH值至7.0,降溫至53℃；

S3、樹脂吸附：將步驟S2中得到的酶解液用泵打入吸附罐，添加處理好的A98型陰離子交換樹脂，加熱維持料液溫度52℃，攪拌1.5h至天青A試紙檢測酶解液不再顯紅色，打開吸附管下方過濾閥門過濾，收集酶解液；進一步用3倍樹脂體積的純化水對樹脂進行洗滌，收集洗滌液與酶解液合并；

S4、梯度鹽度洗脫：首先配制3倍樹脂體積的2.0%氯化鈉洗脫液和3倍體積的15%氯化鈉的洗脫液，并加熱至52℃，首先向吸附罐中加入1.5倍樹脂體積的2.0%氯化鈉洗脫液，加熱至55℃并攪拌1h，收集洗脫液1，再次向吸附罐中加入1.5倍樹脂體積的2.0%氯化鈉洗脫液，加熱至55℃攪拌1h，收集洗脫液2，合并洗脫液1與洗脫液2，將洗脫液1、洗脫液2和步驟S3得到的酶解液合并得到總蛋白洗脫液；然后向吸附罐中加入1.5倍樹脂體積的15%氯化鈉洗脫液，加熱至55℃攪拌1h，收集洗脫液3；然后再次加入1.5倍樹脂體積的15%氯化鈉洗脫液，加熱至55℃攪拌1h，收集洗脫液4；將洗脫液3與洗脫液4合并即得粗品肝素鈉洗脫液；

S5、活性腸蛋白肽的制備：向步驟S4中得到的總蛋白洗脫液中加入1.8倍料液體積乙醇,經連續流離心機分離得到活性腸蛋白濕品，然后將其轉入減壓真空干燥箱中干燥5h，粉碎后得活性腸蛋白肽粉1410g；

S6、粗品肝素鈉的制備：向上述粗品肝素洗脫液中加入1.8倍料液體積乙醇,靜置6h，去除上清液；取底部粘稠的肝素粗品，加入乙醇脫水，收集粉末狀的粗品肝素鈉，并將其轉入減壓真空干燥箱中干燥5h，粉碎后得粗品肝素鈉97g；

S7、低分子量肝素鈉的制備：將步驟S6制備的粗品肝素鈉溶于1.5%的醋酸溶液中，加入亞硝酸鈉水溶液，調節溶液pH值為2.5，控制溫度在25℃攪拌4h，然后加入4mol/L氫氧化鈉溶液調節溶液pH至中性，升高溫度至40℃，加入硼氫化鈉，對肝素鈉進行還原，再加入6mol/L鹽酸調節溶液pH至3.5，保持30min后再加入4mol/L的氫氧化鈉溶液回調溶液pH至6.5并加入反應液2.5倍體積的乙醇，靜置12h后去除上清液，離心收集沉淀；將沉淀物溶解在氯化鈉水溶液中，用6mol/L鹽酸調節溶液pH值為2.5，保持20min后加入4mol/L的氫氧化鈉溶液調節溶液pH值為6.5，并向其中加入2.5倍體積的乙醇，靜置10h后去除上清液，離心收集沉淀；再將沉淀溶解在蒸餾水中，進行色譜柱分離，分部收集，合并濃度較高的組分，超濾濃縮，乙醇沉淀，靜置后，離心收集沉淀，真空干燥得到低分子量肝素鈉。