[發(fā)明專利]干擾素誘導(dǎo)基因IFIT3對B淋巴細(xì)胞活化及分化影響的研究方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111485277.4
• 申請日: 2021-12-07
• 公開（公告）號: CN114231611A
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃向陽;毛妮;彭笑菲;陳誼月
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;G01N33/50;G01N33/68
• 代理公司: 北京中索知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11640
• 代理人: 秦國鵬

1.干擾素誘導(dǎo)基因IFIT3對B淋巴細(xì)胞活化及分化影響的研究方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟1：收集臨床上確診的SLE患者以及健康對照者的外周血，F(xiàn)icoll提取其外周血單個核細(xì)胞(PBMC),同時采用免疫磁珠分選純化B細(xì)胞，流式檢測B細(xì)胞中的IFIT3的表達(dá)差異；

步驟2：通過體外誘導(dǎo)生發(fā)中心B細(xì)胞(iGCB)培養(yǎng)、熒光定量PCR(qRTPCR)技術(shù)檢測IFIT3轉(zhuǎn)錄本的變化情況；Western-blot檢測IFIT在B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞時不同時間點的表達(dá)水平；分子克隆技術(shù)構(gòu)建小鼠pCMV-IFIT3的GFP融合蛋白質(zhì)粒，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體過表達(dá)IFIT3，利用iGCB系統(tǒng)體外誘導(dǎo)漿細(xì)胞分化，流式檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒載體過表達(dá)IFIT3后B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞的變化情況；

步驟3：通過iGCB系統(tǒng)過表達(dá)IFIT3誘導(dǎo)分化為漿細(xì)胞(iPC)，流式分析檢測B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞的主要調(diào)節(jié)因子IRF4、Pax5以及Bcl6；Western-blot檢測IFIT3對非經(jīng)典NFκB信號通路的影響；利用CRISPR/Cas9技術(shù)采用受精卵胞漿注射的方式構(gòu)建Ifit3敲除的MRL/Lpr小鼠；

步驟4：利用質(zhì)譜、免疫共定位、Western-blot、分子克隆等技術(shù)探索IFIT3蛋白的表觀遺傳修飾。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾素誘導(dǎo)基因IFIT3對B淋巴細(xì)胞活化及分化影響的研究方法，其特征在于：步驟1中Ficoll密度梯度離心法提取人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的具體流程為：

(1)先加入與血液樣本等量的Ficoll分離液于一支15ml離心管中；

(2)用吸管小心吸取血液樣本輕輕地加于分離液之液面上，450-650g，離心20-30min；

(3)離心后，離心管中由上至下分為四層；首層為血漿層；第二層為云霧狀乳白色淋巴細(xì)胞層；第三層為透明分離液層；第四層為紅細(xì)胞層；

(4)用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一15ml離心管中，向所得離心管中加入5ml1XPBS清洗，混勻細(xì)胞；

(5)250g，離心10min；

(6)棄上清；

(7)用5ml1XPBS清洗PBMC，重懸所得細(xì)胞；

(8)250g，4℃低溫離心10min；

(9)重復(fù)6、7、8，棄上清后以0.5ml后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾素誘導(dǎo)基因IFIT3對B淋巴細(xì)胞活化及分化影響的研究方法，其特征在于：所述步驟1中磁珠分選純化人PBMC中的B淋巴細(xì)胞并進(jìn)行流式檢測流程為：

(1)細(xì)胞計數(shù)5x10^7cells/ml，將細(xì)胞懸液加到流式管中；

(2)每樣品中加50ul/ml的Cocktail；

(3)在2中添加IsolationCocktail，混合后室溫孵育5分鐘；

(4)震蕩樣品30秒；

(5)加入50ul/ml的RapidSpheres，混勻后室溫下孵育3分鐘；

(6)加1XMACS以補充樣品至2.5ml，用吸管輕輕吹勻；磁力架上分離5分鐘；

(7)從磁鐵上取下流式管，放置新管(無蓋)插入磁鐵和孵化第二次分離5分鐘；

(8)轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液到新的離心管中備用；

(9)流式抗體胞內(nèi)孵育染色,流式細(xì)胞儀檢測。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾素誘導(dǎo)基因IFIT3對B淋巴細(xì)胞活化及分化影響的研究方法，其特征在于：所述步驟2中構(gòu)建小鼠pCMV-IFIT3質(zhì)粒的具體流程為：

(1)設(shè)計引物，從小鼠的脾臟cDNA文庫中PCR擴(kuò)增提取小鼠的IFIT3基因片段；

(2)選擇pCMVIRESEGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過BglII和BamHI酶切位點進(jìn)行雙酶切；

(3)LIC連接酶切后的載體和IFIT3基因片段；

(4)轉(zhuǎn)化提質(zhì)粒；

(5)酶切鑒定；

(6)基因測序；

(7)WesternBlot檢測。