[發明專利]干擾素誘導基因IFIT3對B淋巴細胞活化及分化影響的研究方法

在審

• 申請號: 202111485277.4
• 申請日: 2021-12-07
• 公開（公告）號: CN114231611A
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 黃向陽;毛妮;彭笑菲;陳誼月
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅二醫院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;G01N33/50;G01N33/68
• 代理公司: 北京中索知識產權代理有限公司 11640
• 代理人: 秦國鵬

本發明屬于基因科技技術領域，具體為干擾素誘導基因IFIT3對B淋巴細胞活化及分化的研究方法，包括步驟1：收集臨床上確診的SLE患者以及健康對照者的外周血，Ficoll提取其外周血單個核細胞(PBMC),同時采用免疫磁珠分選純化B細胞；步驟2：通過體外誘導生發中心B細胞(iGCB)培養、熒光定量PCR(qRTPCR)技術檢測IFIT3轉錄本的變化情況；步驟3：通過iGCB系統過表達IFIT3誘導分化為漿細胞(iPC)，流式分析檢測B細胞分化為漿細胞的主要調節因子IRF4、Pax5以及Bcl6；步驟4：利用質譜、免疫共定位、Western?blot、分子克隆等技術探索IFIT3蛋白的表觀遺傳修飾，探討干擾素誘導基因IFIT3對B淋巴細胞活化、分化功能的影響，為闡明狼瘡發病機制、尋找未來治療狼瘡的靶點提供科學依據。

技術領域

本發明涉及基因科技技術領域，具體為干擾素誘導基因IFIT3對B淋巴細胞活化及分化影響的研究方法。

背景技術

B淋巴細胞產生抗體介導體液免疫應答是其主要功能之一，其經過BCR的基因重排后可產生特異性中和抗原的抗體，B淋巴細胞免疫應答過程中可激活補體，發揮調理作用和ADCC作用等免疫系統相關反應。B淋巴細胞還能提呈可溶性抗原，并產生細胞因子參與免疫調節。當B淋巴細胞免疫耐受異常時，可產生異常的免疫應答，分泌大量自身抗體和細胞因子，大量的自身抗體可直接介導細胞破壞或者細胞功能異常，從而發揮致病作用。自身抗體可累及多個器官和組織，涉及復雜的炎癥性反應。

B細胞是由骨髓中共同淋巴前體細胞發育而形成，其發育過程是高度調控的。B細胞發育過程中，通過嚴格調控器表面的表面分子以及B細胞受體而達到調控B細胞的胞內信號的作用。在這個過程中，B細胞獲得完整、有效且不針對自身抗原的B細胞受體，即BCR，需要經過陽性選擇和陰性選擇。BCR呈“Y”型，其由兩條重鏈和兩條輕鏈組成。在B細胞發育的早期，先通過VDJ重排合成一條重鏈，即前體BCR。前體BCR與替補的臨時輕鏈VpreB和λ5組成早期BCR形式。當該早期的BCR能夠識別骨髓間質中的抗原時，B細胞即接收來自BCR的信號而存活進入下一階段的分化過程。當重排的重鏈和臨時替補的輕鏈結合不能有效識別抗原，從而不能介導的有效的BCR信號，這類B細胞隨即凋亡從而被淘汰。該過程稱為陽性選擇，即選擇出有效的前體BCR。

當B細胞經過陽性選擇后，B細胞開始復制擴增。并且隨之下調臨時配對的輕鏈的表達。此時開始真正的輕鏈的重排。重排后的輕鏈與重鏈配對遷移至B細胞膜表面，形成BCR。當新形成的BCR能夠識別骨髓間質中的表面抗原，從而介導B細胞的凋亡，或者接觸骨髓間質中的游離的抗原時，B細胞出現失能。當然輕鏈重排過程中會經歷有限次數的重新編輯，如果重新編輯后的輕鏈與重鏈配對后仍然識別自身抗原，該B細胞將會被淘汰。該過程稱為克隆刪除，即陰性選擇。然而仍然會有部分自身反應性的B細胞會逃離中心耐受選擇而到外周。

系統性紅斑狼瘡(Systemiclupuserythematosus,SLE)是一種比較典型的自身免疫性疾病，常與多系統損傷和機體內多種抗體的大量堆積相關聯。其發病機制中最突出的是B淋巴細胞功能亢進或者過度活化而產生大量多克隆性免疫球蛋白和針對自身組織的自身抗體，因此，厘清B細胞在發育過程中免疫耐受的打破以及自身抗體產生的原因是剖析系統性紅斑狼瘡疾病的發病機制重要理論基礎。

B淋巴細胞產生抗體介導體液免疫應答，并通過產生特異性抗體聯合其他免疫分子和免疫細胞，阻止和清除入侵機體的病原微生物或其他抗原性異物。正常情況下，B細胞在骨髓發育過程中會經歷中心耐受的選擇，針對自身抗原的B細胞以細胞凋亡和失能的方式被淘汰。然而，仍存在少許針對自身抗原起反應的B細胞發育并逃逸到外周。因此，在某些外界誘因存在的情況下，例如體細胞分正常死亡，導致細胞內的核酸及蛋白成分的在組織非正常暴露，自身免疫系統的平衡被打破，逃逸的自身反應性B細胞識別組織中暴露的胞內蛋白及核酸成分而被激活、增殖、分化，產生針對自身抗原的抗體。大量自身抗體的出現是診斷狼瘡發病的關鍵，有時自身抗體可在有其他免疫失調的證據前出現。