[發明專利]一種重組大腸桿菌及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202111485206.4
• 申請日: 2021-12-07
• 公開（公告）號: CN114395518A
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 章文明;姜岷;陶雨萱;信豐學;王含笑;蔣羽佳
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/52;C12N15/61;C12N15/70;C12N15/66;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 肖明芳

本發明公開一種重組大腸桿菌，其基于細胞膜改造提高大腸桿菌抗逆性和產物合成性能，具體通過導入表達了來自谷氨酸棒桿菌的氧化應激調節酶的基因whiB (NCBI ID:AKL15_01645)與來自銅綠假單胞菌的不飽和脂肪酸順反異構酶的基因cti（NCBI ID:CWI20_17990）來實現。本發明的重組菌株可以在厭氧條件下耐受高濃度底物與產物的抑制，同時可以在5L發酵罐厭氧條件下，提升菌株生長量與丁二酸積累。

技術領域

本發明屬于生物工程及其發酵技術領域，一種重組大腸桿菌及其構建方法和應用。

背景技術

丁二酸，又名琥珀酸，是一種常見的天然有機酸，廣泛存在于人體、動物、植物和微生物中。丁二酸不僅是TCA循環的中間產物，而且是厭氧代謝的終端還原產物之一，在生物代謝過程中具有非常重要的作用。且丁二酸及其衍生物應用廣泛，可以作為C4平臺化合物合成1,4-丁二醇、四氫呋喃以及聚丁二酸丁二醇酌(PBS)類生物可降解聚酯，在食品、醫藥、印刷等各個行業應用廣泛。近年來，隨著化石資源利用與環境保護的沖突日益嚴重，采用生物法制備丁二酸符合綠色、可再生等環境友好型生產規定，前景廣闊。

相比傳統化學合成法工藝復雜、條件苛刻、依賴石油等缺點，生物法具有原料價格低廉、污染小等優勢。但是，發酵菌株是丁二酸生物合成的關鍵點之一，只有部分菌株可產高濃度的丁二酸。且生物合成法需要不斷優化合成路徑、改造工程菌株以達到工業化高產高效的目的。其中Escherichia coli由于遺傳背景清楚，基因改造簡單，生長速度快以及所用培養基簡單廉價，近年來成為生物法制備丁二酸的研究熱點。

由于在菌株發酵過程中產物的不斷積累，需要加堿調節pH來維持菌體的最適生長。但在發酵后期，菌株的生長仍受到較大抑制，高濃度底物與高濃度產物帶來的抑制不能被堿液調節所完全緩解。因此，提升菌株的抗逆性能成為了一個新的突破口。

發明內容

發明目的：為解決現有技術中存在的技術問題，本發明提供了一種重組大腸桿菌及其應用。

為實現上述目的，本發明提供了一種重組大腸桿菌，其導入了表達來自谷氨酸棒桿菌的其導入了表達來自谷氨酸棒桿菌的氧化應激調節酶的基因whiB(NCBI ID:AKL15_01645)與來自銅綠假單胞菌的不飽和脂肪酸順反異構酶的基因cti(NCBI ID:CWI20_17990)，其中，基因WhiB的序列號為NCBI ID:AKL15_01645；基因cti的序列號為NCBI ID:CWI20_17990；所述宿主菌為保藏號為CCTCCNO：M2012351的大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)BER208。所述大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BER208的保藏日期為2012年9月14日，保藏單位全稱為中國典型培養物保藏中心，地址為中國武漢，武漢大學，其詳細內容披露于專利CN102864113A中。

本發明進一步提出了上述重組大腸桿菌的構建方法，通過將表達來自谷氨酸棒桿菌的氧化應激調節酶的基因whiB與來自銅綠假單胞菌的不飽和脂肪酸順反異構酶的基因cti構建到保藏號為CCTCCNO：M2012351的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BER208中得到。

具體地，構建方法包括如下步驟：

(1)目的基因片段whiB和cti的獲得；

(2)使用一步克隆法將目的基因片段克隆至出發質粒上，得到重組質粒；

(3)將測序正確的陽性克隆質粒轉化入宿主菌大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BER208中，再通過Amp抗性篩選得到所述抗逆性能提升的產丁二酸的重組大腸桿菌。

優選地，所述出發質粒為pTrc99A質粒。