[發(fā)明專利]一種重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111485206.4
• 申請(qǐng)日: 2021-12-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114395518A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 章文明;姜岷;陶雨萱;信豐學(xué);王含笑;蔣羽佳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/52;C12N15/61;C12N15/70;C12N15/66;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 肖明芳

1.一種重組大腸桿菌，其特征在于，其導(dǎo)入了表達(dá)來(lái)自谷氨酸棒桿菌的氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)酶的基因whiB與來(lái)自銅綠假單胞菌的不飽和脂肪酸順?lè)串悩?gòu)酶的基因cti，其中，基因whiB的序列號(hào)為NCBI ID: AKL15_01645；基因cti的序列號(hào)為NCBI ID: CWI20_17990；所述宿主菌為保藏號(hào)為CCTCCNO：M2012351的大腸埃希氏菌（Escherichia coli）BER208。

2.權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，通過(guò)將表達(dá)來(lái)自谷氨酸棒桿菌的氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)酶的基因whiB與來(lái)自銅綠假單胞菌的不飽和脂肪酸順?lè)串悩?gòu)酶的基因cti構(gòu)建到保藏號(hào)為CCTCCNO：M2012351的大腸埃希氏菌（Escherichia coli）BER208中得到。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）目的基因片段whiB和cti的獲得；

（2）使用一步克隆法將目的基因片段克隆至出發(fā)質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒；

（3）將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌大腸埃希氏菌（Escherichia coli）BER208中，再通過(guò)Amp抗性篩選得到所述抗逆性能提升的產(chǎn)丁二酸的重組大腸桿菌。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述出發(fā)質(zhì)粒為pTrc99A質(zhì)粒。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（2）中，設(shè)計(jì)攜帶酶切位點(diǎn) HindⅢ以及載體 pTrc99A 同源臂的引物，插入線性化的基因片段whiB、cti，得到克隆質(zhì)粒pTrc99A-whiB-cti。

6.權(quán)利要求1或權(quán)利要求5所述的重組大腸桿菌在制備丁二酸中的應(yīng)用。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述重組大腸桿菌降低發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸中高濃度底物和高濃度產(chǎn)物的抑制作用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述重組大腸桿菌可在底物含有90 g/L的葡萄糖或產(chǎn)物中含有30 g/L的丁二酸鈉和60 g/L的葡萄糖為碳源的發(fā)酵體系中發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。

9.一種提高大腸桿菌抗逆性和產(chǎn)物合成性能的方法，其特征在于，通過(guò)將表達(dá)來(lái)自谷氨酸棒桿菌的氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)酶的基因whiB與來(lái)自銅綠假單胞菌的不飽和脂肪酸順?lè)串悩?gòu)酶的基因cti導(dǎo)入到大腸桿菌中，其中，基因whiB的序列號(hào)為NCBI ID: AKL15_01645；基因cti的序列號(hào)為NCBI ID: CWI20_17990。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌的保藏號(hào)為CCTCCNO：M2012351的大腸埃希氏菌（Escherichia coli）BER208。