[發明專利]一種人工改造的β-半乳糖苷酶GaLT1及其在水解乳糖中的應用

在審

• 申請號: 202111483822.6
• 申請日: 2021-12-07
• 公開（公告）號: CN114149987A
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發明（設計）人: 彭惠;孔慧慧;李藝冰;王煜;吳海芳;高毅
• 申請（專利權）人: 安徽大學
• 主分類號: C12N9/38
• 分類號: C12N9/38;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責任公司 34101
• 代理人: 喬恒婷

本發明公開了一種人工改造的β?半乳糖苷酶GaLT1及其在水解乳糖中的應用，所述β?半乳糖苷酶GaLT1是在來源于T.scotoductus的野生型β?半乳糖苷酶GaLT0的N端氨基酸序列連接了一個人工改造的雙親短肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本發明β?半乳糖苷酶GaLT1相較于野生型的β?半乳糖苷酶GaLT0的溫度穩定性得到了顯著改善，55℃的半衰期提高10倍；此外，β?半乳糖苷酶GaLT1的牛奶乳糖降解率也明顯提高，55℃、2h內能降解牛奶中95％的乳糖，達到無乳糖奶制品的國家標準。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種人工改造的β-半乳糖苷酶GaLT1及其在水解乳糖中的應用。

背景技術

乳糖是一種二糖，由葡萄糖和半乳糖組成。牛奶中乳糖含量十分豐富。部分人群的小腸黏膜的乳糖酶分泌不足甚至不分泌，導致無法有效水解乳糖，該癥狀稱為乳糖不耐癥。目前市場上已出現針對該消費人群的無乳糖奶制品(乳糖含量0.5％，w/w，衛監督發[2007]300 號)。制備這些無乳糖奶制品的常見方法是利用乳糖酶(即β-半乳糖苷酶，β-gaLactosidase， EC:3.2.1.23)對牛奶中的乳糖進行降解。

β-半乳糖苷酶廣泛分布在動物、植物和微生物中。目前，已有兩款商品化的β-半乳糖苷酶，但是價格偏貴、水解時間偏長。例如商品化的黑曲霉來源的β-半乳糖苷酶在55℃實現牛奶中乳糖的徹底降解，需要水解12h(Rosolen et al 2015)；商品化的克魯維酵母來源的β-半乳糖苷酶在2℃實現牛奶中乳糖的徹底降解需要24h(Horner et al 2011)。

β-半乳糖苷酶的牛奶乳糖水解分為三種策略。一是低溫(10℃以下)長時間水解。往往是把酶作為食品添加劑添加到牛奶中，利用牛奶的儲存期進行水解。這對酶的食品源來源有很苛刻的要求；二是中溫(37℃左右)水解，該溫度是很多微生物的最佳繁殖溫度，因此酶解全程必須在嚴格的無菌條件下進行，成本和工藝要求高；三是高溫(55℃以上)短時間水解。該技術可以把固定化酶水解乳糖和巴氏殺菌耦合，工藝二合一，效率也更高；而且酶往往制備為固定化酶，不向牛奶中引入外源蛋白，安全性高。因此，探索高溫β-半乳糖苷酶一直是生產無乳糖奶制品研究的熱點之一。

目前有不少高溫β-半乳糖苷酶的報道，但一些高溫的β-半乳糖苷酶的熱穩定性并不高。例如，Sandra W等報道的β-半乳糖苷酶在最適溫度50℃下的半衰期僅為10min；ArreoLa等報道的β-半乳糖苷酶在最適溫度55℃下的半衰期僅為8min。一些熱穩定性較好的高溫β-半乳糖苷酶的水解活性卻比較低。例如，中國發明專利201210127007.0中的β-半乳糖苷酶在 65-69℃時僅能水解牛奶中80％的乳糖；中國發明專利201510358266.8中的β-半乳糖苷酶在 60℃時僅能水解牛奶中約70％的乳糖。因此，挖掘同時滿足熱穩定性好和乳糖水解率高的高溫β-半乳糖苷酶，對無乳糖奶制品行業的發展具有重要意義。

提高酶的熱穩定性的方法很多，融合雙親短肽是一種比較好的方法，不容易引起酶催化活性的下降。目前雙親短肽的設計方案多種多樣，有不少成功的報道，但是同時也有不少無效甚至更差的報道。例如，中國發明專利201810069643.X中嘗試了7條不同的雙親短肽對一個葡萄糖氧化酶的溫度穩定性的影響，發現有1條雙親短肽會使酶的穩定性變差，其余對酶的穩定性都有不同程度的提升，但是最高的在60℃僅僅孵育30min。中國發明專利2109776686A中報道了在一個脂肪酶的N端分別融合2個不同的雙親短肽，略微提高了酶的熱穩定性。該脂肪酶本身的熱穩定性比較差，半衰期僅25min，雙親肽融合后的酶的半衰期提高到35和45min。雙親短肽的氨基酸的種類和長度都會影響酶的性質，而且沒有一個明顯的規律。這就要求在試驗中，設計多種雙親短肽，通過試驗測試，找到具體某個酶的相對最佳匹配的雙親短肽。

發明內容