[發(fā)明專利]一種以火龍果莖尖為材料的染色體及核型分析方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111482949.6
• 申請(qǐng)日: 2021-12-07
• 公開（公告）號(hào): CN114279780A
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 湯華;丁一
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 海南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N1/28
• 分類號(hào): G01N1/28;G01N1/30;G01N21/84
• 代理公司: 廣東中衢知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44755
• 代理人: 林靜濤

本發(fā)明涉及一種以火龍果莖尖為材料的染色體及核型分析方法。具體以火龍果幼嫩莖尖為實(shí)驗(yàn)材料，利用幼嫩莖尖具備分裂旺盛的分生區(qū)組織細(xì)胞的特征，進(jìn)行染色體形態(tài)觀察研究。方法包括以下步驟：將健康幼嫩的火龍果莖尖剪下后進(jìn)行解剖處理；將解剖好的莖尖放入秋水仙素和8?羥基喹啉混合液中進(jìn)行染色體濃縮；用KCl浸泡莖尖；用固定液冷藏固定莖尖；清洗固定后的根尖，將其放入HCl中解離；清洗解離后的莖尖，放入纖維素酶和果膠酶的混合液中進(jìn)行酶解；清洗酶解后的莖尖放入雙蒸餾水中進(jìn)行后低滲處理；將后低滲的莖尖放入固定液中冷藏處理；將莖尖至于載玻片上，切取，染色，制片，以待鏡檢。此發(fā)明克服了火龍果氣生根取材困難，火龍果根尖取材麻煩且對(duì)植株有破壞性，實(shí)驗(yàn)效果不穩(wěn)定的問題。本發(fā)明首次以火龍果莖尖為材料，實(shí)現(xiàn)了火龍果的染色體核型分析，將對(duì)火龍果染色體的核型研究、種質(zhì)資源的倍性鑒定等相關(guān)研究，提供更為便捷和穩(wěn)定的技術(shù)支持。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種以火龍果莖尖為材料的染色體及核型分析方法，屬于植物細(xì)胞學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域研究。

背景技術(shù)

植物染色體是植物細(xì)胞中包含重要遺傳信息的聚合體，其在細(xì)胞分裂時(shí)期易于被堿性染料染色并可以在顯微鏡下觀察呈現(xiàn)出棒狀或圓柱狀。染色體核型分析就是通過染色體數(shù)量、形態(tài)特征、著絲點(diǎn)位置、端粒有無等染色體特征信息進(jìn)行觀察研究，對(duì)染色體信息進(jìn)行分析的方法。

火龍果是仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereus)或蛇鞭柱屬(Seleniereus)的新型熱帶特色水果，起源于中美洲熱帶雨林地區(qū)。量天尺屬植物的染色體基數(shù)是11，并且大對(duì)數(shù)品種都屬于二倍體(2n＝2x＝22)，同時(shí)通過種質(zhì)收集、人工雜交育種等研究，已經(jīng)獲得了三倍體、四倍體、五倍體、六倍體火龍果植株(劉順枝，劉政浩，林潤(rùn)儀等.白肉火龍果染色體制片技術(shù)及核型分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,42(03):115-118+193.)。針對(duì)火龍果的染色體相關(guān)研究，還處于發(fā)展階段，核型分析研究的報(bào)道也很少。關(guān)于火龍果的核型分析研究方法，基本都是用常規(guī)的根尖壓片法或者火龍果氣生根壓片法，相對(duì)于根尖壓片法，火龍果氣生根壓片法更方便，但是火龍果氣生根的催生并不穩(wěn)定，材料難以獲得，而根尖取材也相對(duì)比較麻煩，實(shí)驗(yàn)成功率不高。因此建立一種更方便、更穩(wěn)定的火龍果染色體核型研究的方法，將對(duì)火龍果的染色體觀察與核型分析、種質(zhì)資源分類的倍性鑒定及育種工作提供重要的技術(shù)支撐。

發(fā)明內(nèi)容

為了上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種以火龍果莖尖為材料的染色體核型分析研究方法，使得在顯微鏡下可以清晰觀察各種染色體形態(tài)，進(jìn)行核型與倍性研究。

為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明提供技術(shù)方法如下：

步驟1：取材、預(yù)處理

選取健康、幼嫩的火龍果莖尖，并將其解剖得到火龍果植株中心莖尖；

步驟2：濃縮

將解剖得到的火龍果莖尖放入0.2％秋水仙素與0.002M的8-羥基喹啉混合液中，常溫下放置至少2h。

步驟3：前低滲

濃縮后的莖尖用0.075M的KCl在常溫下浸泡。

步驟4：前固定

將莖尖放入卡諾氏固定液(無水乙醇：冰醋酸＝3:1)中，放置4℃冷藏固定4h以上。

步驟5：解離

將洗去卡諾氏固定液后的莖尖放入1M的HCl中，進(jìn)行解離。

步驟6：酶解

將解離后的莖尖放入2.5％纖維素酶和2.5％果膠酶的混合液中，在常溫下放置至少1h。

步驟7：后低滲

將經(jīng)過酶解的莖尖清洗放入雙蒸餾水中低滲10-30min。

步驟8：后固定

將后低滲的莖尖放入卡諾氏固定液中，在4℃下冷藏固定20—30min，如不能及時(shí)制片使用，可將莖尖漂洗之后放入75％的酒精中，4℃保存。