[發明專利]一種以火龍果莖尖為材料的染色體及核型分析方法

在審

• 申請號: 202111482949.6
• 申請日: 2021-12-07
• 公開（公告）號: CN114279780A
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發明（設計）人: 湯華;丁一
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30;G01N21/84
• 代理公司: 廣東中衢知識產權代理事務所(普通合伙) 44755
• 代理人: 林靜濤

1.一種以火龍果莖尖為材料的染色體及核型分析方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：取材、預處理

選取健康、幼嫩的火龍果莖尖，并將其解剖得到火龍果植株中心莖尖；

步驟2：濃縮

將解剖得到的火龍果莖尖放入0.2％秋水仙素與0.002M的8-羥基喹啉混合液中，常溫下放置至少2h；

步驟3：前低滲

濃縮后的莖尖用0.075M的KCl在常溫下浸泡；

步驟4：前固定

將莖尖放入卡諾氏固定液(無水乙醇：冰醋酸＝3:1)中，放置4℃冷藏固定4h以上；

步驟5：解離

將洗去卡諾氏固定液后的莖尖放入1M的HCl中，進行解離；

步驟6：酶解

將解離后的莖尖放入2.5％纖維素酶和2.5％果膠酶的混合液中，在常溫下放置至少1h；

步驟7：后低滲

將經過酶解的莖尖清洗放入雙蒸餾水中低滲10-30min；

步驟8：后固定

將后低滲的莖尖放入卡諾氏固定液中，在4℃下冷藏固定20—30min，如不能及時制片使用，可將莖尖漂洗之后放入75％的酒精中，4℃保存；

步驟9：染色、制片

將莖尖置于載玻片上，切取1-2mm，滴加10％改良苯酚品紅染色液，蓋上蓋玻片，染色20-40min，染色結束后用蒸餾水洗去多余染料，并用濾紙吸去多余液體；壓片過程中使用帶有橡皮的鉛筆輕輕敲擊蓋玻片，使得莖尖組織和細胞可以均勻的分散在載玻片上；

步驟10：鏡檢

使用光學顯微鏡進行觀察，先用低倍鏡進行觀察，找到合適的視野及分裂相后轉到高倍鏡進行觀察、拍照。

2.根據權利要求1所述的一種以火龍果莖尖為材料的染色體及核型分析方法，其特征在于：步驟1中選用火龍果植株健康、幼嫩的莖尖為材料，并將其進行解剖。

3.根據權利要求1所述的一種以火龍果莖尖為材料的染色體及核心分析方法，其特征在于：步驟2中，將解剖得到的火龍果植株莖尖放入0.2％秋水仙素與0.002M的8-羥基喹啉混合液中，常溫下放置2h。

4.根據權利要求1所述的一種以火龍果莖尖為材料的染色體及核型分析方法，其特征在于：步驟3中，使用0.075M的KCl將莖尖浸泡120min。

5.根據權利要求1所述的一種以火龍果莖尖為材料的染色體及核型分析方法，其特征在于：步驟4中，將莖尖放入卡諾氏固定液中于4℃下冷藏4h以上，卡諾氏固定液為無水乙醇：冰醋酸＝3:1。

6.根據權利要求1所述的一種以火龍果莖尖為材料的染色體及核型分析方法，其特征在于：步驟5中，將洗去卡諾氏固定液后的莖尖放入1M的HCl中，常溫下放置90min，進行解離50min。

7.根據權利要求1所述的一種以火龍果莖尖為材料的染色體及核型分析方法，其特征在于：步驟6中，將解離后的莖尖放入2.5％纖維素酶和2.5％果膠酶的混合液中，在常溫下放置1h。

8.根據權利要求1所述的一種以火龍果莖尖為材料的染色體及核型分析方法，其特征在于：步驟7中，將經過酶解的莖尖清洗放入雙蒸餾水中低滲30min。

9.根據權利要求1所述的一種以火龍果莖尖為材料的染色體及核型分析方法，其特征在于：步驟8中，將后低滲的莖尖放入卡諾氏固定液中，在4℃下冷藏固定30min，如不能及時制片使用，可將莖尖漂洗之后放入75％的酒精中，4℃保存。

10.根據權利要求1所述的一種以火龍果莖尖為材料的染色體及核型分析方法，其特征在于：步驟9中，將莖尖置于載玻片上，切取2mm，滴加10％改良苯酚品紅染色液，蓋上蓋玻片，染色40min，染色結束后用蒸餾水洗去多余染料，并用濾紙吸去多余液體；壓片過程中使用帶有橡皮的鉛筆輕輕敲擊蓋玻片，使得莖尖組織和細胞可以均勻的分散在載玻片上。