[發明專利]一種與特定短肽標簽融合能高效催化Reb M生成的重組酶

有效

• 申請號: 202111481579.4
• 申請日: 2021-12-06
• 公開（公告）號: CN114196696B
• 公開（公告）日: 2023-10-20
• 發明（設計）人: 馬媛媛;李亞桐;魏曉珍;汪振洋;宋浩
• 申請（專利權）人: 天津大學;中化健康產業發展有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/75;C12N15/81;C12N15/54;C12N1/21;C12N1/19;C12N9/10;C12P19/56;C12P19/18;C12R1/19;C12R1/125;C12R1/84;C12R1/865
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 琪琛

本發明公開了一種與特定短肽標簽融合的能高效催化Reb M生成的重組酶，主要構建步驟為：將四個短肽標簽的DNA片段分別構建至線性化質粒pET?UGT2中，獲得重組質粒，轉入宿主細胞，獲得重組菌。本發明將編碼與特定短肽標簽融合的UGT2的核酸序列用于制備能夠催化萊鮑迪苷D生成萊鮑迪苷M的重組蛋白，相比于野生型的UGT2蛋白，制備出的四個重組蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達均明顯提高。在55℃溫浴15min后，Sr76AC2及Sr76AC3重組酶的可溶蛋白殘余量分別為UGT2的4.60倍和4.33倍，展現出比UGT2更好的熱穩定性。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種與特定短肽標簽融合的UGT2重組酶，在增強糖基轉移酶UGT2的可溶性表達，以及重組菌株在萊胞迪苷M生產中的應用。

背景技術

甜菊葉是南美洲人們所廣泛使用的一種天然甜味劑，近年來，已經從中鑒定出超過35種甜菊糖苷混合物。新發現的萊鮑迪苷M(Rebaudioside M，Reb M)的甜度最高，約為蔗糖的400倍，苦味或澀味更為輕微。在歐盟法規(EC)No 1333/2008中將其規定為可以使用的食品添加劑。

Reb M在甜菊葉中約占總細胞干重的0.4—0.5％，從2公斤的甜菊葉中可提純得到1.1g Reb M(純度98％)，因此直接從甜菊屬植物中提純Reb M，無法滿足工業化經濟生產的需求。隨著Reb M合成途徑基因被逐漸揭示，利用酶法催化生成Reb M的方式受到了越來越多的關注。

在天然甜葉菊體內，UDP—糖基轉移酶UGT2催化Reb D生成Reb M。經檢索，在大腸桿菌(Escherichia coli)系統中對UGT2進行異源表達及表達優化，得到重組蛋白酶，可用于催化Reb D生成Reb M。然而該重組蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達較低，為后續純化造成困難且限制了催化Reb D生成Reb M的活性。

基于現有技術的缺陷，亟需優化UGT2在大腸桿菌中的可溶性表達，以高效的催化Reb D生成Reb M。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供一種與特定短肽標簽融合能高效催化Reb M生成的重組酶，解決現有技術中UGT2在大腸桿菌中可溶性表達不佳的問題。

本發明的技術方案如下：

增強重組蛋白可溶性表達的應用，所述重組載體的核酸序列為：

a)SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8所示的任一核苷酸序列；或

b)與a)的核苷酸序列不同，能夠編碼SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列。

在一些實施方案中，本發明提供了一種重組載體，所述重組載體中含有：

a)SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；或

b)與a)的核苷酸序列不同，能夠編碼SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列。

在一些實施方案中，所述重組載體包括pPICZα-A/B/C、pPIC9K、pPIC9、pPinkα-HC、pYES2、YCplac33、YEplac195、pHT01、pHT08、pHT43、pET系列載體、pMAL、pCOLD系列載體和pBAD系列載體中的任意一種。

當宿主細胞為巴斯德畢赤酵母時，重組載體可以為pPIC9K、pPIC9和pPinka-HC中的任意一種。

當宿主細胞為釀酒酵母，選用表達載體可以為pYES2、YCplac33和YEplac195中的任意一種；

當宿主細胞為枯草芽孢桿菌時，選用表達載體可以為pHT01、pHT08和pHT43中的任意一種。