[發(fā)明專利]一種完全降解硝基苯的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111478911.1
• 申請(qǐng)日: 2021-12-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113957031A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧永東;姚泉洪;田永生;張文慧;彭日荷;許晶;王波;李振軍;高建杰;韓紅娟;王麗娟;王宇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/53;C12N15/55;C12N15/60;C12N15/61;C12N15/70;C02F3/34;C12R1/19;C02F101/38
• 代理公司: 北京中濟(jì)緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 劉濤

本發(fā)明提供了一種完全降解硝基苯的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，涉及基因工程領(lǐng)域，構(gòu)建方法包括如下步驟：將來(lái)源于惡臭假單胞菌屬的十個(gè)基因nbzA,nbzB,nbzCa,nbzcb,nbzD,nbzE,nbzF,nbzG,nbzH,和nbzI按照大腸桿菌的密碼子偏好性進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，獲得nbzAS,nbzBS,nbzCaS,nbzCbS,nbzDS,nbzES,nbzFS,nbzGS,nbzHS,和nbzIS基因；選擇T7啟動(dòng)子和終止子控制所述優(yōu)化后的十個(gè)個(gè)基因的表達(dá)，完成優(yōu)化后的十個(gè)基因原核表達(dá)單元的拼接；在兩個(gè)相容質(zhì)粒基礎(chǔ)上組裝硝基苯完全降解的表達(dá)單元；將帶有硝基苯完全降解的表達(dá)單元的雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)入帶有T7RNAP基因的大腸桿菌，獲得含有十個(gè)基因原核表達(dá)單元的大腸桿菌工程菌株。該工程菌能在8h內(nèi)將濃度3mM的硝基苯完全降解，該工程菌具備降解有機(jī)污染物硝基苯的能力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體而言，涉及一種完全降解硝基苯的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

硝基苯，是一類硝基芳香族化合物，廣泛應(yīng)用于各種工業(yè)，如醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、炸藥等行業(yè)。然而，隨著工業(yè)的發(fā)展大量硝基苯污染物被排放到環(huán)境中。硝基苯對(duì)環(huán)境的危害包括兩個(gè)方面：一方面，這些物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致癌癥、畸形和突變，根據(jù)1986年的癌癥指南，硝基苯被歸類為B2組致癌物質(zhì)，另一方面，由于苯環(huán)結(jié)構(gòu)的對(duì)稱性和穩(wěn)定性，不易降解，因此硝基苯會(huì)長(zhǎng)期存在和積累，嚴(yán)重威脅著人和其他生物的健康。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)硝基苯類化合物廢水的治理方法總體上可以歸納為物理法、化學(xué)法、生物法以及三者的混合技術(shù)等四類。物理法包括氣提法、萃取法，吸附法等，吸附法是最主要的硝基苯物理治理方法。

物理法是硝基苯廢水處理中最常用的一種方法，具有處理快，效果好，通量大的優(yōu)點(diǎn)，但是成本較高，易造成二次污染，且不能將硝基苯徹底去除。

化學(xué)法主要是利用氧化反應(yīng)來(lái)消除污染物，主要有H₂O₂氧化法、光催化氧化法、臭氧氧化法、脈沖放電等離子體處理法、超臨界水氧化法和超聲波氧化法等技術(shù)。化學(xué)法造成的二次污染較物理法少，但還是存在費(fèi)用偏高的問(wèn)題。常用的理化方法相對(duì)于生物法來(lái)說(shuō)成本高且易引起二次污染。

生物法主要是利用微生物的代謝活性處理環(huán)境中的有機(jī)污染物，通過(guò)人工馴化自然界的菌種或者構(gòu)建基因工程菌降解污染物，最終使污染物礦化。對(duì)于可快速降解污染物的菌株的分離、培養(yǎng)和應(yīng)用是生物修復(fù)法的重要環(huán)節(jié)。由于其費(fèi)用低、效率高、無(wú)二次污染、能夠最大程度地降低污染物的濃度而倍受關(guān)注，己成為處理有機(jī)污染物的理想方法。隨著生物強(qiáng)化技術(shù)和基因工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用和發(fā)展，利用生物法處理高濃度下難徹底降解的有機(jī)物對(duì)環(huán)境的污染具有廣泛應(yīng)用前景。因此，獲得一種能有效降解硝基苯的工程菌，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)利用生物修復(fù)有機(jī)污染物是亟需解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種完全降解硝基苯的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，將來(lái)源于惡臭假單胞菌屬的的基因片段進(jìn)行合成優(yōu)化，利用分子生物學(xué)技術(shù)，將異源代謝途徑導(dǎo)入到大腸桿菌體內(nèi)，最終獲得能有效降解硝基苯的大腸桿菌工程菌，進(jìn)而達(dá)到利用生物修復(fù)有機(jī)污染物的問(wèn)題。

第一方面，本發(fā)明提供一種完全降解硝基苯的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建方法包括如下步驟：

將來(lái)源于惡臭假單胞菌屬的十個(gè)基因nbzA,nbzB,nbzCa,nbzcb,nbzD,nbzE,nbzF,nbzG,nbzH,和nbzI按照大腸桿菌的密碼子偏好性進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，獲得nbzAS,nbzBS,nbzCaS,nbzCbS,nbzDS,nbzES,nbzFS,nbzGS,nbzHS,和nbzIS基因；

選擇T7啟動(dòng)子和終止子控制所述優(yōu)化后的十個(gè)個(gè)基因的表達(dá)，完成優(yōu)化后的十個(gè)基因原核表達(dá)單元的拼接；

在兩個(gè)相容質(zhì)粒基礎(chǔ)上組裝硝基苯完全降解的表達(dá)單元；