[發明專利]一種完全降解硝基苯的大腸桿菌工程菌的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202111478911.1
• 申請日: 2021-12-06
• 公開（公告）號: CN113957031A
• 公開（公告）日: 2022-01-21
• 發明（設計）人: 鄧永東;姚泉洪;田永生;張文慧;彭日荷;許晶;王波;李振軍;高建杰;韓紅娟;王麗娟;王宇
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/55;C12N15/60;C12N15/61;C12N15/70;C02F3/34;C12R1/19;C02F101/38
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 劉濤

1.一種完全降解硝基苯的大腸桿菌工程菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

將來源于惡臭假單胞菌屬的十個基因nbzA,nbzB,nbzCa,nbzcb,nbzD,nbzE,nbzF,nbzG,nbzH,和nbzI按照大腸桿菌的密碼子偏好性進行結構優化，獲得nbzAS,nbzBS,nbzCaS,nbzCbS,nbzDS,nbzES,nbzFS,nbzGS,nbzHS,和nbzIS基因；

選擇T7啟動子和終止子控制所述優化后的十個個基因的表達，完成優化后的十個基因原核表達單元的拼接；

在兩個相容質粒基礎上組裝硝基苯完全降解的表達單元；

將帶有硝基苯完全降解的表達單元的雙質粒轉入帶有T7RNAP基因的大腸桿菌，獲得含有十個基因原核表達單元的大腸桿菌工程菌株。

2.如權利要求1所述完全降解硝基苯的大腸桿菌工程菌的構建方法，其特征在于，所述nbzA,nbzB,nbzCa,nbzCb,nbzD,nbzE,nbzF,nbzG,nbzH,和nbzI基因的核苷酸序列分別如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示。

3.一種在大腸桿菌中表達的硝基苯降解酶基因組，其特征在于，所述基因組按照大腸桿菌的密碼子偏好性進行結構優化，獲得nbzAS,nbzBS,nbzCaS,nbzCbS,nbzDS,nbzES,nbzFS,nbzGS,nbzHS,和nbzIS基因，其核苷酸序列分別如SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQID No.19、SEQ ID No.20所示。

4.一種在大腸桿菌中表達的硝基苯降解酶基因組，其特征在于，優化后的10個基因分別與T7啟動子和終止子融合，分別單獨構建基因表達單元；所述T7啟動子和終止子序列分別見SEQ IDNo.21和SEQ IDNo.22所示。

5.如權利要求1所述完全降解硝基苯的大腸桿菌工程菌的構建方法，其特征在于，選擇兩個不同復制起點和抗性標記的相容質粒pCamBIA1301和pUC19，將硝基苯完全降解10個基因表達盒組裝成兩大功能模塊。

6.如權利要求5所述完全降解硝基苯的大腸桿菌工程菌的構建方法，其特征在于，其中nbzCaS,nbzCbS,nbzDS,nbzES,nbzFS,nbzGS基因的表達單元組裝到質粒pCamBIA1301上，nbzHS,nbzIS基因的表達單元組裝到質粒pUC19上,獲得兩個多基因表達載體。

7.一種用于完全降解硝基苯的大腸桿菌工程菌，其特征在于，所述大腸桿菌工程菌是將權利要求6所述的兩個多基因大腸桿菌轉化載體導入大腸桿菌EG61-BL21-AI，獲得的陽性菌株。

8.如權利要求7所述完全降解硝基苯的大腸桿菌工程菌在降解硝基苯中應用。