[發(fā)明專利]一種基于熒光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管緊張素酶互作檢測細(xì)胞模型及應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2021-11-30
• 公開（公告）號: CN114134121A
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉建喜;張志恒;孟慶余;高永靜
• 申請（專利權(quán)）人: 南通大學(xué)
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/62;C12N15/85;C12Q1/66;C12Q1/02;C12R1/91
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32249
• 代理人: 馬玉雯

本發(fā)明公開了一種基于熒光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管緊張素酶互作檢測細(xì)胞模型及應(yīng)用，采用NanoBiT熒光素酶互補(bǔ)原理，在ACE2蛋白的氨基端和RBD羧基端分別接入熒光素大小亞基，兩者互補(bǔ)得到有功能的可催化熒光底物發(fā)光的功能性復(fù)合物。利用該方法檢測蛋白抑制劑活性具有靈敏，快捷，信號強(qiáng)、可逆、干擾小、檢測方便和成本可控等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于熒光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管緊張素酶互作檢測細(xì)胞模型及應(yīng)用。

背景技術(shù)

新型冠狀病毒通過病毒包膜上棘突蛋白(S蛋白)(RBD)與人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)結(jié)合進(jìn)而侵染細(xì)胞，達(dá)到傳播的目的。因此RBD和ACE2的相互作用就成為了篩選抑制新型冠狀病毒傳播的藥物靶點(diǎn)。

目前針對于ACE2和RBD相互作用為藥物靶點(diǎn)的藥物篩選方法有：(1)等溫滴定量熱法(ITC)和表面等離子體共振(SPR)。這些方法存在的問題是無法進(jìn)行大規(guī)模高通量篩選。(2)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、飽和轉(zhuǎn)移差(STD)NMR、免疫共沉淀和微尺度熱電泳法。這些方法存在的問題是在實(shí)驗(yàn)過程中，確定實(shí)驗(yàn)條件有些難度，實(shí)行起來不是很方便。(3)AlphaLISA法。該方法存在的問題是易受環(huán)境氧的干擾。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于提供一種基于熒光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管緊張素酶互作檢測細(xì)胞模型及應(yīng)用。本發(fā)明采用的是NanoBiT熒光素酶互補(bǔ)原理，在ACE2蛋白的氨基端和RBD羧基端分別接入熒光素大小亞基，兩者互補(bǔ)得到有功能的可催化熒光底物發(fā)光的功能性復(fù)合物。利用該方法檢測蛋白抑制劑活性具有靈敏，快捷，信號強(qiáng)、可逆、干擾小、檢測方便和成本可控等優(yōu)點(diǎn)。

一種基于熒光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管緊張素酶互作檢測細(xì)胞模型，所述細(xì)胞模型的構(gòu)建方法為：

通過將熒光素酶小亞基(SmBiT)連接到RBD羧基端得到RBD-SmBiT標(biāo)簽蛋白，將熒光素酶大亞基(LgBIT)連接到ACE2氨基端得到LgBiT-ACE2標(biāo)簽蛋白；將含編碼表達(dá)標(biāo)簽蛋白的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，標(biāo)簽蛋白通過信號肽引導(dǎo)，使之跨膜分泌到培養(yǎng)基中，再從從細(xì)胞培養(yǎng)基中利用其中的組氨酸標(biāo)簽進(jìn)行純化。

進(jìn)一步的，所述RBD-SmBiT標(biāo)簽蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進(jìn)一步的，所述LgBiT-ACE2標(biāo)簽蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述細(xì)胞模型在新冠病毒RBD和ACE2相互作用抑制劑的高通量篩選中的應(yīng)用，具體包括以下步驟：

1)含有熒光素酶亞基的RBD-SmBiT和LgBiT-ACE2標(biāo)簽蛋白底物中熒光素酶活性的滴定；將純化的RBD-SmBiT和LgBiT-ACE2標(biāo)簽蛋白按照1：2不同的濃度梯度連續(xù)稀釋到384孔板中，根據(jù)其活性確定具體實(shí)驗(yàn)時所用的稀釋濃度；

2)利用自動分液器將稀釋好的RBD-SmBiT標(biāo)簽蛋白加入384孔板中，每孔加10μL；

3)稀釋待篩選化合物至50μM，加入5μL/孔50mM的化合物到步驟2)的384孔板中，室溫下孵育30分鐘，讓化合物充分結(jié)合RBD-SmBiT標(biāo)簽蛋白；

4)在步驟3)經(jīng)過孵育后的384孔板中加入稀釋好的LgBiT-ACE2標(biāo)簽蛋白，每孔加10μL，混勻離心收集，室溫反應(yīng)30分鐘；

5)加入25μL熒光底物，混勻離心收集，室溫平衡10分鐘讀板。

進(jìn)一步的，所述步驟1)具體的做法是RBD-SmBiT標(biāo)簽蛋白按坐標(biāo)橫向稀釋，LgBiT-ACE2標(biāo)簽蛋白按縱向稀釋。稀釋的體積各為10μL。稀釋混勻好后，加入20μL熒光底物檢測熒光素酶的活性。

有益效果