[發明專利]一種基于熒光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管緊張素酶互作檢測細胞模型及應用

在審

• 申請號: 202111473851.4
• 申請日: 2021-11-30
• 公開（公告）號: CN114134121A
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 劉建喜;張志恒;孟慶余;高永靜
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/62;C12N15/85;C12Q1/66;C12Q1/02;C12R1/91
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 馬玉雯

1.一種基于熒光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管緊張素酶互作檢測細胞模型，其特征在于，所述細胞模型的構建方法為：

通過將熒光素酶小亞基連接到新冠病毒棘突蛋白的羧基端得到RBD-SmBiT標簽蛋白，將熒光素酶大亞基連接到人血管緊張素酶2的氨基端得到LgBiT-ACE2標簽蛋白；將含編碼表達標簽蛋白的質粒直接轉染HEK293細胞，標簽蛋白通過信號肽引導，使之跨膜分泌到培養基中，再從從細胞培養基中利用其中的組氨酸標簽進行純化。

2.根據權利要求1所述一種基于熒光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管緊張素酶互作檢測細胞模型，其特征在于，所述RBD-SmBiT標簽蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根據權利要求1所述一種基于熒光素酶的新冠病毒棘突蛋白和人血管緊張素酶互作檢測細胞模型，其特征在于，所述LgBiT-ACE2標簽蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根據權利要求1-3任一所述細胞模型在新冠病毒RBD和ACE2相互作用抑制劑的高通量篩選中的應用。

5.根據權利要求4所述應用，其特征在于，具體包括以下步驟：

1)含有熒光素酶亞基的RBD-SmBiT和LgBiT-ACE2標簽蛋白底物中熒光素酶活性的滴定；將純化的RBD-SmBiT和LgBiT-ACE2標簽蛋白按照1：2不同的濃度梯度連續稀釋到384孔板中，根據其活性確定具體實驗時所用的稀釋濃度；

2)利用自動分液器將稀釋好的RBD-SmBiT標簽蛋白加入384孔板中，每孔加10μL；

3)稀釋待篩選化合物至50μM，加入5μL/孔50mM的化合物到步驟2)的384孔板中，室溫下孵育30分鐘，讓化合物充分結合RBD-SmBiT標簽蛋白；

4)在步驟3)經過孵育后的384孔板中加入稀釋好的LgBiT-ACE2標簽蛋白，每孔加10μL，混勻離心收集，室溫反應30分鐘；

5)加入25μL熒光底物，混勻離心收集，室溫平衡10分鐘讀板。

6.根據權利要求5所述應用，其特征在于，所述步驟1)具體的做法是RBD-SmBiT標簽蛋白按坐標橫向稀釋，LgBiT-ACE2標簽蛋白按縱向稀釋。稀釋的體積各為10μL。稀釋混勻好后，加入20μL熒光底物檢測熒光素酶的活性。