[發(fā)明專利]一種高效表達(dá)GDH的工程菌株及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111471201.6
• 申請(qǐng)日: 2021-12-03
• 公開（公告）號(hào): CN114231475A
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳劍清;徐晨;唐文杰;王可盈;戴銳;呂正兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江清肽生物科技有限公司;浙江理工大學(xué)紹興生物醫(yī)藥研究院有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12N15/53;C12N9/04;C12R1/19
• 代理公司: 浙江納祺律師事務(wù)所 33257
• 代理人: 鄭滿玉;王士祥

本發(fā)明公開的是一種高效表達(dá)GDH的工程菌株及其制備方法和應(yīng)用，高效表達(dá)GDH的工程菌，含有SEQ ID NO1所述序列的質(zhì)粒，利用大腸桿菌rosetta(DE3)作為宿主菌，工程菌株構(gòu)建方法：將GDH原始基因構(gòu)建到PET?14b質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)，產(chǎn)生出高效表達(dá)GDH的工程菌，重組GDH蛋白的純化方法：誘導(dǎo)表達(dá)工程菌，菌液離心集菌后，超聲破碎，收集破碎后上清；上清利用鎳柱親和層析；超濾脫鹽，凍干保存，本發(fā)明通過將GDH原始基因構(gòu)建到PET?14b中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，能夠高效表達(dá)GDH，酵液酶活高，發(fā)酵時(shí)間短、效率高，降低了生產(chǎn)成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種工程菌株及其制備方法和應(yīng)用，更具體一點(diǎn)說，涉及一種高效表達(dá)GDH的工程菌株及其制備方法和應(yīng)用，屬于基因工程和發(fā)酵優(yōu)化領(lǐng)域。

背景技術(shù)

葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase,EC1.1.1.47)是一種NAD(P)+依賴型的氧化還原酶，可以催化NAD(P)+與β_D-葡萄糖反應(yīng)得到NAD(P)H和D-葡萄糖酸-8-內(nèi)酯。GDH在生物催化和燃料電池方面得到越來越廣泛的應(yīng)用。GDH是芽孢桿菌屬細(xì)菌體內(nèi)與芽孢形成有關(guān)的酶，在形成芽孢時(shí)被誘導(dǎo)生成是D-核糖生物合成途徑中的限制性酶。目前葡萄糖脫氫酶已被用于測(cè)定體液中葡萄糖含量和制備微型生物傳感器，其基因的克隆及其序列分析已有報(bào)道，但該酶的高活性表達(dá)和理想的活性檢測(cè)方法未見報(bào)道。但是GDH來源較少，主要來源于動(dòng)物肝臟和芽孢桿菌發(fā)酵。

芽孢桿菌來源的天然葡萄糖脫氫酶的穩(wěn)定性差，它僅在芽孢形成的后期發(fā)現(xiàn)，而在營養(yǎng)體檢測(cè)不到葡萄糖脫氫酶的活性。這些葡萄糖脫氫酶脫離了芽孢的保護(hù)后，在不添加任何保護(hù)劑的情況下，于40℃開始失活。

Bacillusmegaterium IAM1030中GDH是目前所知穩(wěn)定性最差的，它在10℃就開始失活，在40℃下處理20min后就完全失去活性，這樣的熱穩(wěn)定性是無法達(dá)到工業(yè)要求。GDH在生物催化和燃料電池方面得到越來越廣泛的應(yīng)用。但是GDH來源較少，主要來源于動(dòng)物肝臟和芽孢桿菌發(fā)酵。目前迫切需要解決這個(gè)問題。因此，有必要發(fā)展一套穩(wěn)定性較強(qiáng)的高效表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)GDH。目前，大腸桿菌商業(yè)化表達(dá)系統(tǒng)主要涉及單基因、單載體誘導(dǎo)表達(dá)，不適合多基因、多載體協(xié)同表達(dá)。而且中心法則已闡明，基因轉(zhuǎn)錄成mRNA，再翻譯成蛋白質(zhì)。這個(gè)過程受到各種調(diào)控，例如DNA甲基化、乙酰化、小RNA、啟動(dòng)子強(qiáng)度、RBS翻譯效率、酶的濃度和活性、分裂周期等。對(duì)于大腸桿菌而言，啟動(dòng)子、RBS、酶濃度和細(xì)菌生長狀態(tài)是影響目標(biāo)蛋白表達(dá)量的主要因素。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供具有能夠高效表達(dá)GDH，酶活是每克菌體比活高等技術(shù)特點(diǎn)的一種高效表達(dá)GDH的工程菌株。

本發(fā)明還提供了一種高效表達(dá)GDH的工程菌株的制備方法和應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明一種高效表達(dá)GDH的工程菌，含有SEQ ID NO1所述序列的質(zhì)粒。

優(yōu)選的，所述工程菌利用大腸桿菌rosetta(DE3)作為宿主菌。

本發(fā)明一種重組GDH蛋白，通過培養(yǎng)誘導(dǎo)如權(quán)利要求1或2所述的工程菌獲得。

本發(fā)明一種重組GDH蛋白的純化方法，其特征在于該純化方法包含以下步驟：

A：誘導(dǎo)表達(dá)權(quán)利要求1或2所述的工程菌，菌液離心集菌后，超聲破碎，收集破碎后上清；

B：上清利用鎳柱親和層析；

C：超濾脫鹽，凍干保存。

優(yōu)選的，步驟B中鎳柱洗脫液采用咪唑，所述咪唑濃度為200-500mmol/L。

本發(fā)明一種工程菌，或重組GDH蛋白在制備GDH產(chǎn)品中的應(yīng)用。