[發(fā)明專利]鑒別無籽油棕的SSR標(biāo)記引物、應(yīng)用及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111470335.6
• 申請日: 2021-12-03
• 公開（公告）號: CN113981131B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 石鵬;張大鵬;王永
• 申請（專利權(quán)）人: 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 海口翔翔專利事務(wù)有限公司 46001
• 代理人: 張耀婷

本發(fā)明涉及種苗繁育技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于與無籽相關(guān)的S?RNase基因序列設(shè)計SSR引物、應(yīng)用及利用SSR標(biāo)記鑒別無籽油棕的方法，先提取油棕種苗的DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并染色，即可根據(jù)電泳條帶鑒別出無籽和有籽油棕。本發(fā)明所述的鑒別無籽油棕的方法，無需等到油棕樹結(jié)果，在苗期即可準(zhǔn)確鑒定出將來會產(chǎn)生無籽果實(shí)的油棕種苗，鑒定準(zhǔn)確率高，能夠保證油棕種苗的純度，對于油棕種苗質(zhì)量控制具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于種苗繁育技術(shù)領(lǐng)域，涉及分子標(biāo)記應(yīng)用的鑒定方法，具體涉及利用SSR標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用、鑒別無籽油棕的方法。

背景技術(shù)

油棕是世界重要的油料作物，果實(shí)是唯一的產(chǎn)油器官，中果皮壓榨得到棕櫚油，種子破殼后得到種仁，種仁壓榨得到棕櫚仁油。目前，商業(yè)品種大多為薄殼種(Tenera)和厚殼種(Dura)，油脂壓榨過程中均需要破殼工序，其中薄殼種由厚殼種和無殼種(Pisifera)雜交得來。在對油棕種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定過程中，我們發(fā)現(xiàn)一類無籽油棕。具體表現(xiàn)為果實(shí)中沒有種子和種殼，全部為果肉(圖1)。無籽油棕在榨油過程中無需破殼工序，可以直接壓榨，減少了加工成本，產(chǎn)油率也會相應(yīng)提高。

無籽油棕品種的推廣需要大量無籽油棕種苗，種苗的早期鑒定至關(guān)重要。油棕商業(yè)育苗主要采用種子育苗和組培育苗，幼苗生長3-4年才會開花結(jié)果，無籽性狀才能觀察到。因此，在育苗階段鑒定種苗基因型十分必要。SSR分子標(biāo)記技術(shù)步驟簡單、時間短、成本低，在其他作物中也有大量成功應(yīng)用的報道。在對無籽、無殼、薄殼油棕雌花轉(zhuǎn)錄組分析的基礎(chǔ)上，選取可能導(dǎo)致無籽的S-RNase基因?yàn)槟康幕颍贜CBI中下載金魚草S-RNase基因序列(HE805271.1和AJ315593.1)、茄科S-RNase基因序列(D63887.1和AB568389.1)、薔薇科S-RNase基因序列(FJ543097.1和AF327223.1)，將這些序列與油棕基因組比對，發(fā)現(xiàn)與油棕KE607205.1、ASJS01098507.1、CM002081.1基因組序列相似度較高，隨后用這些基因組序列在WebSat在線工具(https://bioinfo.inf.ufg.br/websat/)上設(shè)計了20對SSR引物，在華大基因合成引物，最后用于鑒別無籽油棕實(shí)驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于與無籽相關(guān)的S-RNase基因序列設(shè)計SSR引物，應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)在育苗階段對油棕的無籽性狀進(jìn)行早期鑒定，對于油棕種苗質(zhì)量控制及種植業(yè)發(fā)展具有重要意義，在油棕種苗繁育領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：提供一種鑒別無籽油棕的SSR標(biāo)記引物，包括兩對引物組，分別為P16和P19；所述P16引物的正向引物的序列如SEQ?ID?NO.1所示，反向引物的序列如SEQ?ID?NO.2所示，所述P19引物的正向引物的序列如SEQ?ID?NO.3所示，反向引物的序列如SEQ?ID?NO.4所示。

本發(fā)明的另一目的在于提供鑒別無籽油棕的SSR標(biāo)記引物在育苗階段對油棕的無籽性狀進(jìn)行早期鑒定中的應(yīng)用。

本發(fā)明的再一目的在于提供鑒別無籽油棕的方法，步驟如下：

步驟S1，取0.05-0.1g油棕葉片提取基因組DNA，稀釋濃度到200ng/μl；

步驟S2，配制20ul反應(yīng)體系對DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增方式為梯度降落法，擴(kuò)增條件為：94℃變性5min，94℃變性30s，退火溫度從65°降到56℃，運(yùn)行10個循環(huán)，每個循環(huán)降低1℃，55℃退火25個循環(huán)，每個循環(huán)45s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min，之后4℃保存；

步驟S3，PCR產(chǎn)物中加入1μl?6×染料混合，取0.8-1.0μl混合液，在6％聚丙烯酰胺凝膠上點(diǎn)樣，電泳后銀染，觀察250-500bp之間的條帶情況進(jìn)行無籽油棕鑒定：250-500bp之間有條帶的為有籽油棕(厚殼種、薄殼種、無殼種)，沒有條帶的為無籽油棕。