[發明專利]一種廣譜性狂犬病病毒樣顆粒抗原的設計及其穩定表達細胞株HEK-293

在審

• 申請號: 202111469929.5
• 申請日: 2021-12-03
• 公開（公告）號: CN114262365A
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發明（設計）人: 馬興元;趙章婷;鄭文云;鄧昌平
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C07K14/145
• 分類號: C07K14/145;C12N15/85;C12N15/47;C12N15/65;C12N5/10;A61K39/205;A61P31/14
• 代理公司: 上海順華專利代理有限責任公司 31203
• 代理人: 李鴻儒

1.一種廣譜性狂犬病病毒樣顆粒抗原，其特征在于，包括CVS株狂犬病病毒糖蛋白RVGP和基質蛋白RVMP，所述CVS株狂犬病病毒糖蛋白RVGP經密碼子優化的多核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述基質蛋白RVMP經密碼子優化的多核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根據權利要求1所述的廣譜性狂犬病病毒樣顆粒抗原，其特征在于：

其中，所述CVS株狂犬病病毒糖蛋白RVGP具有4個可能的N-糖基化位點Asn56、Asn266、Asn338和Asn484，前3個位于RVGP的胞外域，第4個位于RVGP的胞質尾區；

CVS株狂犬病病毒糖蛋白RVGP的胞外域含有B細胞表位、CLT細胞表位和Th細胞表位，并且Asn56和Asn266包含于B細胞表位中，Asn338包含于CTL細胞表位中。

3.權利要求1或2所述的廣譜性狂犬病病毒樣顆粒抗原的設計方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)利用在線網站NCBI獲取CSV株RVGP和RVMP的蛋白序列；

2)通過在線軟件ABCpredprediction server預測RVGP抗原序列中B細胞表位，幫助定位抗原表位區域，這些區域可用于確定候選疫苗；

3)通過在線軟件BioXGEM.PAComplex和SYFPEITHI預測RVGP中潛在的CTL表位；

4)通過在線軟件RANKPEP預測RVGP中潛在的Th表位；

5)通過在線軟件NetNGlyc 1.0Server預測RVGP中的N-糖基化位點；

6)通過2)-4)中的生物信息學軟件以及PyMOL軟件分析糖基化位點突變后RVGP的抗原表位和三級結構的改變；

7)從NCBI獲取34株從中國不同地區分離的RVGP氨基酸序列，利用DNAMAN軟件對獲取的RVGP與CSV株RVGP進行序列比對，確定候選RVGP與中國來源的RVGP的序列一致性，進而判定其是否可以作為中國動物用ORV的候選抗原。

4.含有權利要求1或2所述的廣譜性狂犬病病毒樣顆粒抗原的真核重組表達質粒。

5.權利要求3所述的真核重組表達質粒的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)以真核質粒為模板，分別擴增啟動子、SV40 PA和熒光蛋白；

2)以啟動子、SV40 PA為模板，重疊延伸PCR擴增目的片段SV40 PA-CMV和SV40PA-CMV；

3)以SV40 PA-CMV和熒光蛋白為模板，重疊延伸PCR擴增目的片段SV40PA-CMV-EGFP。

6.根據權利要求5所述的真核重組表達質粒的構建方法，其特征在于：

其中，所述真核重組表達質粒中，RVGP、RVMP以及熒光蛋白都具有獨立的啟動子、核糖體結合位點和PloyA尾。

7.表達權利要求1或2所述的廣譜性狂犬病病毒樣顆粒抗原的真核表達系統，其特征在于所述真核表達系統是HEK-293細胞或其他能實現哺乳動物糖翻譯后修飾的哺乳動物細胞。