[發明專利]基于RT-RAA熒光方法檢測乙型腦炎病毒的試劑和試劑盒

有效

• 申請號: 202111462069.2
• 申請日: 2021-12-02
• 公開（公告）號: CN114045362B
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 徐志文;周遠成;朱玲;聶民財;魯令華;鄺山
• 申請（專利權）人: 四川農業大學;畜科生物工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

本發明公開了基于RT?RAA熒光方法檢測乙型腦炎病毒的試劑和試劑盒。所述試劑盒包括檢測乙型腦炎病毒的組合物；所述組合物包括引物JEV?RAA?F2、JEV?RAA?R1和探針；所述引物JEV?RAA?F2的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述JEV?RAA?R1的核苷酸序列如序列3所示；所述探針的核苷酸序列如序列4所示。該試劑盒只需39℃條件下反應30min就可以準確檢測出待測樣本中是否含有乙型腦炎病毒，且具有很高的靈敏性和特異性，最低檢測極限為5.5×10¹copies/μL的JEV陽性標準質粒轉錄本，可以應用于臨床中乙型腦炎病毒的快速高效檢測，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及基于熒光方法RT-RAA檢測乙型腦炎病毒的試劑和試劑盒。

背景技術

乙型腦炎是由乙型腦炎病毒(Japanese?encephalitis?virus，JEV)引起的蟲媒性的人畜均可感染的中樞神經系統的傳染性疾病。該病往往會伴隨出現一些神經系統表現的癥狀，比如高熱、狂暴、精神沉郁或者嚴重昏迷等癥狀。JEV的爆發，常常局限在一定的地理氣候位置上的分布，同時也具有明顯的氣候周期性，多數發生于夏秋兩個季節，這兩季也是蚊類散播傳染病頻繁產生的季節，屬于自然界的疫源性蟲媒散播傳染病。

當仔豬感染病毒后，往往很容易侵襲仔豬的腦部組織，從而出現一系列的神經系統的嚴重癥狀，甚至出現死亡的危險；母豬感染病毒后，在懷孕階段，容易造成母豬流產、產生死胎；公豬感染乙型腦炎病毒后，可引起公豬的睪丸炎或不育，但致死率較母豬來說不高。實際上該病雖然死亡率較低，但其感染持續時間長，病毒危害范圍大，容易造成嚴重的損失和威脅。

重組酶輔助擴增技術(Recombinase?aided?amplification,RAA)是近年新興的一種核酸檢測技術，該方法通過加入重組酶和結合蛋白，使得核酸擴增能在37-42℃條件下快速進行，一般在15-30min即可判定結果。RAA已被廣泛應用于病原體的快速檢測，與RT-PCR和RT-LAMP方法相比較，該方法檢測時間更短，檢測靈敏度與RT-qPCR和RT-LAMP基本一致。

針對乙型腦炎的病原的檢測可以使用RT-PCR、RT-qPCR、RT-LAMP等方法進行檢測，也有RT-RPA-LFD檢測方法(梁輝.流行性乙型腦炎RT-RPA-LFD檢測方法的建立與評價[D].華南農業大學,2016.)的報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是如何快速檢測乙型腦炎病毒或如何制備檢測乙型腦炎病毒的RT-RAA試劑盒。

為了解決上述技術問題，本發明首先提供了檢測乙型腦炎病毒的試劑盒。所述試劑盒包括檢測乙型腦炎病毒的組合物。所述組合物可包括引物JEV-RAA-F2、JEV-RAA-R1和探針。所述引物JEV-RAA-F2的核苷酸序列可如序列表中序列2所示。所述JEV-RAA-R1的核苷酸序列可如序列表中序列3所示。所述探針的核苷酸序列可如序列表中序列4所示。

上文所述試劑盒可為基于熒光RT-RAA技術的試劑盒。

上文所述試劑盒中，所述組合物還可含有RT熒光基礎反應單元。所述RT熒光基礎反應單元可包含單鏈DNA結合蛋白、重組酶、逆轉錄酶和/或DNA聚合酶。

所述RT熒光基礎反應單元可來源于熒光型RT-RAA核酸擴增試劑盒。所述RT熒光基礎反應單元可為凍干粉。

上文所述試劑盒中，所述組合物還可含有鎂離子緩沖液。所述鎂離子緩沖液可為和醋酸鎂。

上文所述試劑盒中，所述探針具可有下述任一修飾或其組合：

A1)在所述探針的5’端起第31位堿基上標記熒光基團。

A2)在所述探針的5’端33位堿基標記淬滅基團。

A3)在所述探針的5’端的31位和32位堿基中間用四氫呋喃修飾。