[發明專利]一種3×FLAG標簽融合表達載體的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 202111457264.6
• 申請日: 2021-12-02
• 公開（公告）號: CN114150008A
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發明（設計）人: 徐玉芳;姚文;李濤;張會勇;林楠;孫玉慧;連紅梅;賈利華;李陽
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/82;C12N5/10
• 代理公司: 西安匯恩知識產權代理事務所(普通合伙) 61244
• 代理人: 張偉花

本發明提供了一種3×FLAG標簽融合表達載體的制備方法，該方法為：用KpnI/XhoI雙酶切pGL3 Basic載體，得到KpnI/XhoI雙酶切pGL3 Basic載體的回收產物，以pRGEB32Bar?Cas9質粒為模板，得到2×35S啟動子PCR回收產物，連接反應得到中間載體pGL?35S，雙酶切后連接MCS退火引物，得到中間載體pGL?35S?MCS，雙酶切后連接Nos Ter序列，得到中間載體pGL?35S?MCS?Nos，雙酶切后連接變性退火的連接肽Linker引物，得到中間載體pGL?35S?MCS?Linker?Nos，雙酶切后連接3×FLAG標簽退火引物，得到3×FLAG標簽融合表達載體。本發明制備的3×FLAG標簽融合表達載體框架較小，全長4088bp，適用于植物原生質體轉化。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種3×FLAG標簽融合表達載體的制備方法及其應用。

背景技術

FLAG是一段由8個氨基酸殘基(N-DYKDDDDK-C)組成的多肽,大約1012Da。在蛋白質表達、蛋白質互作等研究中,可以通過基因工程技術手段將所要研究的目的基因和FLAG多肽序列連接起來,FLAG多肽可以連接在目的蛋白的C端或N端,然后將“目的基因-FLAG”融合后的表達載體轉入細菌、酵母、動物或者植物細胞中。一方面，因為FLAG標簽的分子量很小，所以不會遮蓋住融合蛋白中的蛋白表位和結構域，也不容易改變融合蛋白的功能、定位、分泌和運輸等。FLAG標簽中的四個連續的天冬氨酸(DDDD)帶負電荷，可以讓整個標簽具有天然的親水特性，使得FLAG標簽很容易定位在融合蛋白的表面，便于利用抗體來檢測。另一方面，目前FLAG標簽蛋白的抗體已經商業化大規模生產，很多品牌如國外品牌Sigma、Abcam和國產品牌Abmart、翌圣等的FLAG標簽抗體已廣泛用于“目的基因-FLAG”融合蛋白的定量、定位或者蛋白互作研究，檢測手段有免疫熒光,免疫印記等。

目前植物中FLAG標簽融合表達載體應用較廣泛的多為pCambia1300框架，該載體框架較大，達10Kb以上。該框架多用于農桿菌介導的煙草植株的轉化。盡管應用這種方法可以得到大量表達的“目的基因-FLAG”融合蛋白，但是煙草育苗周期長，農桿菌介導的轉化步驟繁雜。另外，煙草系統無法模擬不同植物本身環境，而對蛋白功能和蛋白互作的研究，特別是利用“目的基因-FLAG”融合蛋白載體系統尋找目的基因在植物體內的互作蛋白時，要求“目的基因-FLAG”融合載體要在所研究的目標植物中表達，此時農桿菌介導的轉化方法在其它植物如擬南芥、水稻、玉米中的應用受到阻礙。

PEG介導的植物原生質體轉化是目前應用較多的融合載體表達系統，但是pCambia1300框架太大，轉化效率低，且pCambia1300框架拷貝數低，無法滿足原生質體轉化系統的大量質粒要求。因此，在實際分子生物學研究中急需一種能用于植物原生質體高效轉化和表達的FLAG標簽融合表達載體。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術的不足，提供一種3×FLAG標簽融合表達載體的制備方法及其應用，該方法制備的3×FLAG標簽融合表達載體pProto-3×FLAG框架較小，全長4088bp，適用于植物原生質體轉化。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種3×FLAG標簽融合表達載體的制備方法，該方法為：

S1、用KpnI/XhoI雙酶切pGL3 Basic載體，在溫度為37℃的條件下反應6h后，將酶切產物用1％瓊脂糖凝膠分離后，切下4.8Kb大小的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收產物，得到KpnI/XhoI雙酶切pGL3 Basic載體的回收產物；