[發(fā)明專(zhuān)利]一種3×FLAG標(biāo)簽融合表達(dá)載體的制備方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111457264.6
• 申請(qǐng)日: 2021-12-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114150008A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐玉芳;姚文;李濤;張會(huì)勇;林楠;孫玉慧;連紅梅;賈利華;李陽(yáng)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/62
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/62;C12N15/82;C12N5/10
• 代理公司: 西安匯恩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61244
• 代理人: 張偉花

1.一種3×FLAG標(biāo)簽融合表達(dá)載體的制備方法，其特征在于，該方法為：

S1、用KpnI/XhoI雙酶切pGL3 Basic載體，在溫度為37℃的條件下反應(yīng)6h后，將酶切產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠分離后，切下4.8Kb大小的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，得到KpnI/XhoI雙酶切pGL3 Basic載體的回收產(chǎn)物；

S2、以pRGEB32Bar-Cas9質(zhì)粒為模板，以特異性引物F1和特異性引物R1為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)克隆2×35S啟動(dòng)子，PCR擴(kuò)增后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠分離，切下677bp大小的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，得到2×35S啟動(dòng)子PCR回收產(chǎn)物；PCR反應(yīng)體系為：2×Pfu Master Mix 10μL，特異性引物F11μL、特異性引物R11μL、pRGEB32Bar-Cas9質(zhì)粒1μL、滅菌超純水補(bǔ)至20μL；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性10min；98℃變性10s，55℃退火10s，68℃延伸40s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；68℃延伸10min；所述特異性引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述特異性引物R1核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

S3、利用同源重組方法將S2中得到的2×35S啟動(dòng)子PCR回收產(chǎn)物中的2×35S啟動(dòng)子連接至S1中得到的KpnI/XhoI雙酶切pGL3 Basic載體的回收產(chǎn)物中pGL3 Basic載體的KpnI/XhoI位點(diǎn)之間，在溫度為50℃的條件下連接反應(yīng)25min，得到pGL-35S連接產(chǎn)物，將所述pGL-35S連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，擴(kuò)增繁殖，用質(zhì)粒提取試劑盒提取后，得到中間載體pGL-35S；

S4、將S3中得到的中間載體pGL-35S用XhoI/SalI雙酶切，在溫度為37℃的條件下酶切反應(yīng)6h后，將酶切產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠分離后，切下3.67Kb大小的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，得到XhoI/SalI雙酶切中間載體pGL-35S的回收產(chǎn)物；

S5、人工合成多克隆位點(diǎn)MCS正向引物和多克隆位點(diǎn)MCS反向引物，將所述多克隆位點(diǎn)MCS正向引物和所述多克隆位點(diǎn)MCS反向引物在95℃的條件下退火5min，得到MCS退火引物；所述多克隆位點(diǎn)MCS正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述多克隆位點(diǎn)MCS反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

S6、將S5中得到的MCS退火引物T4連接至S4中得到的XhoI/SalI雙酶切中間載體pGL-35S的回收產(chǎn)物中pGL-35S的XhoI/SalI位點(diǎn)之間，在溫度為22℃的條件下連接反應(yīng)1h，得到pGL-35S-MCS連接產(chǎn)物；將所述pGL-35S-MCS連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，擴(kuò)增繁殖，用質(zhì)粒提取試劑盒提取后，得到中間載體pGL-35S-MCS；

S7、克隆Nos Ter序列：以pCambia1302質(zhì)粒為模板，以特異性引物F2和特異性引物R2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)克隆Nos Ter序列，PCR擴(kuò)增后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠分離，切下251bp大小的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，得到Nos Ter序列PCR回收產(chǎn)物；PCR反應(yīng)體系為：2×Pfu Master Mix 10μL，特異性引物F21μL、特異性引物R21μL、pCambia1302質(zhì)粒1μL、滅菌超純水補(bǔ)至20μL；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性10min；98℃變性10s，55℃退火10s，68℃延伸20s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；68℃延伸10min；所述特異性引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述特異性引物R2核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

S8、將S6中得到的中間載體pGL-35S-MCS用EcoRI/SalI雙酶切，在溫度為37℃的條件下酶切反應(yīng)6h后，將酶切產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠分離后，切下3.72Kb大小的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，得到EcoRI/SalI雙酶切中間載體pGL-35S-MCS的回收產(chǎn)物；

S9、利用同源重組方法將S7中得到的Nos Ter序列PCR回收產(chǎn)物中的Nos Ter序列連接至S8中得到EcoRI/SalI雙酶切中間載體pGL-35S-MCS的回收產(chǎn)物中的pGL-35S-MCS的EcoRI/SalI位點(diǎn)之間，在溫度為50℃的條件下連接反應(yīng)25min，得到pGL-35S-MCS-Nos連接產(chǎn)物，將所述pGL-35S-MCS-Nos連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，擴(kuò)增繁殖，用質(zhì)粒提取試劑盒提取后，得到中間載體pGL-35S-MCS-Nos；

S10、將S9中得到的中間載體pGL-35S-MCS-Nos用BglII/BamHI雙酶切，溫度為37℃的條件下酶切反應(yīng)6h后，將酶切產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠分離后，切下3.97Kb大小的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，得到BglII/BamHI雙酶切中間載體pGL-35S-MCS-Nos的回收產(chǎn)物；

S11、體外人工合成連接肽Linker正向引物和連接肽Linker反向引物，將所述連接肽Linker正向引物和所述連接肽Linker反向引物在溫度為95℃的條件下退火5min，得到變性退火的連接肽Linker引物；所述連接肽Linker正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述連接肽Linker反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

S12、將S11中得到的變性退火的連接肽Linker引物T4連接至S10中得到的BglII/BamHI雙酶切中間載體pGL-35S-MCS-Nos的回收產(chǎn)物中pGL-35S-MCS-Nos的BglII/BamHI位點(diǎn)之間，在溫度為22℃的條件下連接反應(yīng)1h，得到pGL-35S-MCS-Linker-Nos連接產(chǎn)物；將所述pGL-35S-MCS連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，擴(kuò)增繁殖，用質(zhì)粒提取試劑盒提取后，得到中間載體pGL-35S-MCS-Linker-Nos；

S13、將S12中得到的中間載體pGL-35S-MCS-Linker-Nos用BamHI/EcoRI雙酶切，溫度為37℃的條件下酶切反應(yīng)6h后，將酶切產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠分離后，切下4.01Kb大小的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，得到BamHI/EcoRI雙酶切中間載體pGL-35S-MCS-Linker-Nos的回收產(chǎn)物；

S14、合成3×FLAG標(biāo)簽正向引物和3×FLAG標(biāo)簽反向引物，將所述3×FLAG標(biāo)簽正向引物和所述3×FLAG標(biāo)簽反向引物在溫度為95℃的條件下退火5min，得到3×FLAG標(biāo)簽退火引物；所述3×FLAG標(biāo)簽正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述3×FLAG標(biāo)簽反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

S15、將S14中得到的3×FLAG標(biāo)簽退火引物T4連接至S13中得到的BamHI/EcoRI雙酶切中間載體pGL-35S-MCS-Linker-Nos的回收產(chǎn)物中pGL-35S-MCS-Linker-Nos的BamHI/EcoRI位點(diǎn)之間，在溫度為22℃的條件下連接反應(yīng)1h，得到pGL-35S-MCS-Linker-Nos連接產(chǎn)物；將所述pGL-35S-MCS連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，擴(kuò)增繁殖，用質(zhì)粒提取試劑盒提取后，得到3×FLAG標(biāo)簽融合表達(dá)載體，命名為3×FLAG標(biāo)簽融合表達(dá)載體pProto-3×FLAG；所述3×FLAG標(biāo)簽融合表達(dá)載體pProto-3×FLAG的核苷酸如SEQ ID NO:11所示。