[發明專利]一種基于單質粒的T7噬菌體病毒樣顆粒自組裝方法

有效

• 申請號: 202111456514.4
• 申請日: 2021-12-01
• 公開（公告）號: CN114369610B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發明（設計）人: 唐田;楊加雪;汪川;朱婭嵐;方楚斌
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/64;C12N15/34;C07K14/01;A61K39/385;A61K47/46;C12R1/92
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 王峰剛

本發明屬于病毒樣顆粒(Virus?likeparticles,VLPs)自組裝技術領域，公開了一種基于單質粒的T7噬菌體病毒樣顆粒自組裝方法，該自組裝方法包括：構建表達質粒pRSFDuet?1?gp9?gp10A，將其轉入大腸桿菌BL21(DE3)，經誘導、表達、體內自組裝、初步純化得到T7噬菌體病毒樣顆粒；其中，所述表達質粒pRSFDuet?1?gp9?gp10A中含有T7噬菌體衣殼蛋白編碼基因gp10A以及T7噬菌體支架蛋白編碼基因gp9。本發明提供了一種制備T7噬菌體病毒樣顆粒的新策略，為后續構建基于T7噬菌體病毒樣顆粒的載體疫苗或靶向藥物奠定基礎。

技術領域

本發明屬于病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)自組裝技術領域，尤其涉及一種基于單質粒的T7噬菌體病毒樣顆粒自組裝方法。

背景技術

T7噬菌體是一種宿主為大腸桿菌的烈性噬菌體，其原衣殼(Procapsid)，為T＝7L構象的正二十面體晶格結構，由主要衣殼蛋白(Gp10)、支架蛋白(Gp9)，連接蛋白(Gp18)和核心堆積蛋白(Gp14/Gp15/Gp16)組成。其中，衣殼蛋白Gp10有兩種形式：Gp10A和Gp10B。Gp10B由Gp10A第341位氨基酸翻譯移碼產生，約占總衣殼蛋白的10％。

病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)是一種由一個或多個病毒蛋白組裝形成的、具有類似病毒形態的蛋白顆粒物質，其內部缺乏遺傳物質，不能復制，因此不具有感染性。目前文獻已報道的VLP，直徑多介于25～100nm之間。作為一種生物納米顆粒，病毒樣顆粒具有以下優勢：

(1)成分確定；

(2)直徑較小，可被淋巴結中的抗原遞呈細胞有效攝取，激活免疫應答；

(3)內部中空，可裝載抗原或藥物，實現靶向遞送；

目前尚無利用單質粒共表達gp10A和gp9基因制備T7噬菌體病毒樣顆粒的方法。僅有將T7噬菌體gp10全基因和gp9基因分別克隆到兩個單獨的質粒，并進行表達和體外自主裝的文獻報道，具體如下：

技術1：Mario E等將T7噬菌體gp9基因克隆到質粒pAR441的MSC上，將gp10基因克隆到質粒pAR3625的MSC上，隨后共轉導大腸桿菌BL21(DE3)pLysS菌株，通過誘導、裂解、體外自組裝和純化獲得了T7噬菌體病毒樣顆粒。

然而，表達gp10基因，會形成含兩種衣殼蛋白(Gp10A和Gp10B)的病毒樣顆粒，這種病毒樣顆粒的結構成分不夠確定，不利于在表面嵌入抗原制備載體疫苗；此外，多個表達質粒在遺傳穩定性上也不如單一表達質粒。因此，亟需構建一種更加簡單、穩定的T7噬菌體病毒樣顆粒自組裝方法，以彌補現有技術短板。

通過上述分析，現有技術存在的問題及缺陷為：

(1)通過表達T7噬菌體gp10基因和gp9基因所獲得的病毒樣顆粒，其成分不夠單一和確定，會增加后續衣殼蛋白融合抗原(載體疫苗抗原)的構建難度。

(2)多質粒的遺傳穩定性較差。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種利用單質粒共表達T7噬菌體gp10A和gp9基因，并在大腸桿菌BL21(DE3)菌株內自組裝形成T7噬菌體病毒樣顆粒的方法。

本發明是這樣實現的，一種基于單質粒的T7噬菌體病毒樣顆粒自組裝方法包括：

轉入大腸桿菌BL21(DE3)，經誘導、表達、體內自組裝、初步純化得到T7噬菌體病毒樣顆粒；

其中，所述表達質粒pRSFDuet-1-gp9-gp10A中含有T7噬菌體衣殼蛋白編碼基因gp10A以及T7噬菌體支架蛋白編碼基因gp9。

進一步，所述一種基于單質粒的T7噬菌體病毒樣顆粒自組裝方法包括以下步驟：