[發明專利]一種基于單質粒的T7噬菌體病毒樣顆粒自組裝方法

有效

• 申請號: 202111456514.4
• 申請日: 2021-12-01
• 公開（公告）號: CN114369610B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發明（設計）人: 唐田;楊加雪;汪川;朱婭嵐;方楚斌
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/64;C12N15/34;C07K14/01;A61K39/385;A61K47/46;C12R1/92
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 王峰剛

1.一種基于單質粒的T7噬菌體病毒樣顆粒自組裝方法，其特征在于：

構建表達質粒pRSFDuet-1-gp9-gp10A，轉入大腸桿菌BL21(DE3)，經誘導、表達、體內自組裝、初步純化得到T7噬菌體病毒樣顆粒；

其中，所述表達質粒pRSFDuet-1-gp9-gp10A中含有T7噬菌體衣殼蛋白編碼基因gp10A以及T7噬菌體支架蛋白編碼基因gp9；

包括：

步驟一，合成T7噬菌體gp9和gp10A基因；

步驟二，構建T7噬菌體病毒樣顆粒pRSFDuet-1-gp9-gp10A表達質粒及菌株；

步驟三，T7噬菌體病毒樣顆粒的誘導、表達、體內自組裝；

步驟四，T7噬菌體病毒樣顆粒的初步純化；

步驟五，T7噬菌體病毒樣顆粒的電鏡觀察；

步驟一中，所述T7噬菌體gp9基因的核酸序列為SEQ ID NO：1，所述gp10A基因的核酸序列為SEQ ID NO：2。

2.如權利要求1所述一種基于單質粒的T7噬菌體病毒樣顆粒自組裝方法，其特征在于，步驟二中，所述構建T7噬菌體病毒樣顆粒pRSFDuet-1-gp9-gp10A表達質粒及菌株，包括：

(1)將合成的gp9基因序列插入pRSFDuet-1質粒MCS 1的BamH I和Sac I限制性內切酶位點中，獲得含T7噬菌體gp9基因的表達質粒，命名為pRSFDuet-1-gp9；

(2)將合成的gp10A基因序列插入pRSFDuet1-gp9質粒MCS 2的Nde I和Xho I限制性內切酶位點中，獲得T7噬菌體病毒樣顆粒表達質粒，命名為pRSFDuet-1-gp9-gp10A；

(3)將pRSFDuet-1-gp9-gp10A轉入大腸桿菌BL21(DE3)，獲得T7噬菌體病毒樣顆粒表達菌株，命名為TT-103。

3.如權利要求1所述一種基于單質粒的T7噬菌體病毒樣顆粒自組裝方法，其特征在于，步驟三中，所述T7噬菌體病毒樣顆粒表達菌株的誘導、表達、體內自組裝，包括：

(1)TT-103菌株接種于含終濃度為0.1mg/mL的卡那霉素的LB固體培養基，37℃，18～24h，獲得單菌落；

(2)挑選TT-103單菌落，接種于10mL含終濃度為0.1mg/mL的卡那霉素的LB液體培養液，180rpm/min，37℃，過夜培養；

(3)取5mL步驟(2)培養的菌液，加入到500mL含終濃度為0.1mg/mL的卡那霉素的LB液體培養液，180rpm/min，37℃，培養至OD600約0.5時，加入終濃度為0.1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷異丙基-Β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，100rpm/min，30℃，誘導4h；

(4)誘導結束后，4℃，18000g/min，離心20min，收集菌體，用等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后，將菌體重懸于含1mM PMSF蛋白酶抑制劑的PBS中；

(5)將步驟(4)制得的菌體懸液進行高壓均質破碎，設置壓力為600bar，處理時間為12min，均質溫度為4℃；隨后，18000g/min，4℃，離心20min，收集沉淀和上清液；

(6)利用SDS-PAGE測定步驟(3)未誘導的菌液及步驟(5)獲得的菌體高壓均質沉淀和上清液中的目標蛋白。

4.如權利要求1所述一種基于單質粒的T7噬菌體病毒樣顆粒自組裝方法，其特征在于，步驟四中，所述T7噬菌體病毒樣顆粒的初步純化包括：

(1)35％(w/v)蔗糖墊層緩沖液超高速離心，蔗糖緩沖液與上清液體積比為1：2，100000g，4℃，離心1h，收集上清液，沉淀用緩沖液A重懸；其中，所述緩沖液A包含20mMTris-HCl，250mM KCl，pH＝4.0；

(2)利用SDS-PAGE測定步驟(1)收集的上清液和沉淀中的目標蛋白。

5.如權利要求1所述一種基于單質粒的T7噬菌體病毒樣顆粒自組裝方法，其特征在于，步驟五中，所述T7噬菌體病毒樣顆粒的電鏡觀察，包括：取20ul樣品，滴于銅網上，用3％磷鎢酸負染并吸取多余染液，晾干后，使用透射電鏡觀察分析。