[發(fā)明專利]一種游離DNA(cfDNA)甲基化突變的檢測方法及試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111455145.7
• 申請日: 2021-12-01
• 公開（公告）號: CN114045342A
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李宏志;劉琦;趙金銀;段心語;許立志;李杰
• 申請（專利權(quán)）人: 大連晶泰生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6869;C12Q1/6804
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責(zé)任公司 21212
• 代理人: 周媛媛;李馨

本發(fā)明公開一種cfDNA甲基化突變的檢測方法及試劑盒，屬于癌癥早期篩查技術(shù)領(lǐng)域。首先構(gòu)建cfDNA基因文庫和filler DNA片段，混合后獲得cfDNA基因文庫與filler DNA混合物，加入5?mC抗體進行免疫共沉淀反應(yīng)，對混合物中的DNA甲基化片段進行甲基化捕獲，然后經(jīng)純化、洗脫得到捕獲后產(chǎn)物片段；經(jīng)過擴增富集、純化回收并篩選，得到上機文庫；使用Illumina測序平臺進行測序，通過生物信息學(xué)對得到實驗數(shù)據(jù)進行分析，獲得cfDNA甲基化突變情況。本發(fā)明的檢測方法及試劑盒的檢測靈敏度高，實驗成本低，同時大大降低了傳統(tǒng)檢測出現(xiàn)的假陽性率，使結(jié)果更加可靠。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于癌癥早期篩查技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種新型cfDNA甲基化突變的檢測方法及試劑盒。

背景技術(shù)

惡性腫瘤，俗稱癌癥。由于機體細胞失去正常調(diào)控，過度增殖而失去正常調(diào)控，過度增殖而引起的疾病。癌細胞可發(fā)生發(fā)展于體內(nèi)大多數(shù)器官和組織中，可侵犯周圍組織，甚至可經(jīng)體內(nèi)循環(huán)/淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到身體其他部分。據(jù)統(tǒng)計，癌癥是全球第二大死亡原因，2018年約有1800萬新發(fā)病例以及960萬死亡病例。到2030年，預(yù)計全年將有2600萬新發(fā)病例以及1700萬死亡病例，對人類生命健康具有嚴(yán)重威脅。晚期癌癥通常缺乏有效的治療方法，但癌癥若在早期發(fā)現(xiàn)，生存率將顯著提高，五年生存約為91％，盡可能的在最早階段發(fā)現(xiàn)腫瘤是治療關(guān)鍵。近年來，在癌癥早期診斷研究中，cfDNA已成為一種有前景的腫瘤生物標(biāo)志物，具有巨大的早期診斷潛力。

癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機制的研究基于不同的平臺，涉及基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組和表觀基因組。最近，表觀基因組在正常細胞和癌細胞中的作用得到了證實，并取得了快速進展，表觀基因組主要由DNA甲基化和染色質(zhì)配置調(diào)控，通過改變核小體結(jié)構(gòu)及其定位來調(diào)節(jié)基因表達。在正常人類細胞中，核小體保持開放構(gòu)象，啟動子區(qū)域沒有DNA甲基化位點，而在腫瘤中核小體間距相對封閉。研究表明，DNA甲基化突變已被定義為癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵事件。DNA甲基化發(fā)生于CpG位點，通過DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用，在胞嘧啶堿基的5’碳位置添加一個甲基形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化模式在癌癥中頻發(fā)，包括反轉(zhuǎn)錄因子、著絲粒和癌基因的DNA低甲基化事件等。5mC改變具有區(qū)分癌細胞和正常細胞的能力，其表觀遺傳譜可作為多種腫瘤標(biāo)志物，用于早期診斷檢測、預(yù)后監(jiān)測，成為基因檢測研究熱點。

傳統(tǒng)的DNA甲基化檢測普遍采用重亞硫酸鹽處理后進行高通量測序法，該方法由于cfDNA數(shù)量有限，并且重亞硫酸鹽可導(dǎo)致約84％的DNA降解損失，CpGs全基因組豐度低，信息回收率有限，導(dǎo)致其檢測靈敏度受限，結(jié)果可靠度低，檢測所需成本高。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種基于免疫沉淀的cfDNA甲基化突變的檢測方法以及檢測試劑盒，本發(fā)明的檢測方法靈敏、可靠、無重亞硫酸鹽處理即可進行早期癌癥篩查。

本發(fā)明目的是通過以下方式實現(xiàn)：

本發(fā)明提供一種cfDNA甲基化突變的檢測方法，主要包括以下步驟：

(1)提取全血游離DNA，經(jīng)過末端修復(fù)、末端加“A”、連接illumina測序平臺專用index測序接頭，構(gòu)建cfDNA基因文庫；

(2)將步驟(1)構(gòu)建的cfDNA基因文庫與提前構(gòu)建好的filler DNA混合，獲得cfDNA基因文庫與filler DNA混合物，保證起始投入量達到100ng以上；

(3)將5-甲基胞嘧啶抗體(5-mC抗體)與步驟(2)得到的cfDNA基因文庫與fillerDNA混合物進行免疫共沉淀反應(yīng)，對混合物中的高DNA甲基化片段進行甲基化捕獲，然后經(jīng)純化、洗脫得到捕獲后產(chǎn)物片段；

(4)對步驟(3)所得的產(chǎn)物片段進行擴增富集，然后利用AMPure XP磁珠對擴增產(chǎn)物進行純化回收并篩選，得到最終上機文庫；