[發(fā)明專利]一種游離DNA(cfDNA)甲基化突變的檢測(cè)方法及試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111455145.7
• 申請(qǐng)日: 2021-12-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114045342A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李宏志;劉琦;趙金銀;段心語(yǔ);許立志;李杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 大連晶泰生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/6869;C12Q1/6804
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責(zé)任公司 21212
• 代理人: 周媛媛;李馨

1.一種cfDNA甲基化突變的檢測(cè)方法，其特征在于，主要包括以下步驟：

(1)提取全血游離DNA，經(jīng)過(guò)末端修復(fù)、末端加“A”、連接illumina測(cè)序平臺(tái)專用index測(cè)序接頭，構(gòu)建cfDNA基因文庫(kù)；

(2)將步驟(1)構(gòu)建的cfDNA基因文庫(kù)與提前構(gòu)建好的filler DNA混合，獲得cfDNA基因文庫(kù)與filler DNA混合物；

(3)將5-甲基胞嘧啶抗體與步驟(2)得到的cfDNA基因文庫(kù)與filler DNA混合物進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)，對(duì)混合物中的DNA甲基化片段進(jìn)行捕獲，然后經(jīng)純化得到捕獲后產(chǎn)物片段；

(4)對(duì)步驟(3)所得的產(chǎn)物片段進(jìn)行擴(kuò)增富集，然后利用磁珠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收并篩選，得到最終上機(jī)文庫(kù)；

(5)使用Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得cfDNA甲基化突變情況。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(1)中所述的游離DNA通過(guò)QICirculating Nucleic Acid Kit試劑盒提取獲得；所述的末端修復(fù)、末端加“A”通過(guò)End RepairA-Tailing Enzyme Mix反應(yīng)體系完成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(2)中所述的Filler DNA為6個(gè)不同大小、不同CpG密度的PCR擴(kuò)增子組成，5個(gè)不同CpG密度的片段被甲基化，1個(gè)片段未被甲基化，甲基化片段和未甲基化片段的質(zhì)量比為1:1。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)中所述的甲基化捕獲通過(guò)Diagenode MagMeDIP kit及Diagenode iPure kit V2試劑盒完成；步驟(4)中所述的擴(kuò)增富集通過(guò)LM-PCR進(jìn)行；步驟(5)中所述的Illumina測(cè)序平臺(tái)包括Illmina NextSeq 500、Illumina Hiseq2000、Illumina Hiseq2500和Illumina Miseq。

5.一種用于權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的cfDNA甲基化突變的檢測(cè)方法的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒主要包括以下成分：高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建組分、filler DNA片段、免疫共沉淀反應(yīng)、甲基化捕獲及純化回收組分和文庫(kù)富集組分。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建組分主要包括高通量文庫(kù)構(gòu)建中的末端修復(fù)、加“A”及連接接頭所需要的酶及illumina測(cè)序平臺(tái)專用測(cè)序接頭。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的filler DNA片段以λDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，純化回收，對(duì)所得的PCR片段進(jìn)行甲基化，純化回收后獲得；所述的PCR反應(yīng)所需的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-12所示。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的免疫共沉淀反應(yīng)、甲基化捕獲及純化回收組分主要包括免疫沉淀反應(yīng)所需的緩沖液試劑、抗體蛋白和甲基化捕獲用的磁珠以及用于純化回收所需要的試劑和洗脫buffer。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的文庫(kù)富集組分主要包括文庫(kù)擴(kuò)增所需要的酶及buffer，以及產(chǎn)物回收純化、片段篩選所需要的磁珠。

10.權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)所述的試劑盒在泛癌種早篩中的應(yīng)用。