[發明專利]基于電化學信號底物放大檢測核酸的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202111445857.0
• 申請日: 2021-11-30
• 公開（公告）號: CN116200464A
• 公開（公告）日: 2023-06-02
• 發明（設計）人: 李長明;張嫄媛;劉峰;鄒卓;史轉轉
• 申請（專利權）人: 蘇州科技大學
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12Q1/6825;G01N27/327
• 代理公司: 重慶航圖知識產權代理事務所(普通合伙) 50247
• 代理人: 胡小龍;朱嬌艷

本發明公開了基于電化學信號底物放大檢測核酸的方法及試劑盒，包括在傳感電極上修飾特異識別待測核酸的核酸探針；將傳感電極與待測核酸樣品雜交；然后用電化學酶通過鏈酶親和反應標記的核酸捕獲探針2與已與核酸探針結合的待測核酸雜交形成雙鏈結構。與核酸捕獲探針2結合的電化學酶催化底物使無電化學活性的電化學酶變為電化學活性產物，以參比電極為基準向工作電極加電壓，電化學活性產物釋放產生電子同時產生反應產物，通過測定電流值實現核酸檢測；電化學信號的放大通過調控底物濃度和反應時間實現。該方法對試劑儲存條件要求低，可在多種環境中使用，不受溫度與濕度影響；與傳統的固定生物分子方法相比，靈敏度高，降低樣品用量具有很好的應用前景。

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，具體涉及基于電化學信號底物放大檢測核酸的方法，還涉及利用該方法檢測的試劑盒。

背景技術

免疫傳感，自20世紀70年代以來，特異性免疫反應與靈敏的光學或電化學轉導的結合引起了人們的廣泛關注。由于電化學傳感技術對微型化的適應性，引起了廣泛的研究努力集中在具有高靈敏度和特異性的電化學排列免疫傳感器和生物芯片。構建電化學免疫傳感器的關鍵步驟之一是選擇合適的探針固定方法。最廣泛使用的方法是基于微球的固定化技術當探針被物理吸附或共價結合到帶磁性鐵芯的聚苯乙烯微球表面。雖然這種方法靈敏度高，但這種方法不能提供具有可控空間分辨率的相關免疫試劑，從而限制了其在生物芯片中的應用。另一種替代方法是使用電聚合導體聚合物作為固定化免疫試劑的基質。在福洛斯的開創性工作之后，生物分子如酶、DNA、抗體甚至整個細胞在導電聚合物中的固定化已被廣泛應用于制造生物傳感器，包括免疫傳感器。為提高檢測靈敏度，在酶聯免疫法中的抗體可以用DNA功能化的納米結構標記，該DNA標記的功能化材料可以通過聚合酶鏈式反應、雜交鏈式反應或者滾環擴增技術實現信號放大，通過該項技術，免疫反應的靈敏度與傳統的酶聯免疫法相比，可以提高多個數量級。在基于DNA信號放大的酶聯免疫法中，催化發夾DNA探針自組裝反應和雜交鏈式反應的放大程度有限；聚合酶鏈式反應雖信號放大程度高，但是其反應過程需要嚴格的升溫和降溫過程，限制了其擴大應用。比較而言，滾環擴增放大技術具有獨特的優勢，它采用等溫擴增，可以實現信號分子10⁵到10⁹甚至是指數數量級的放大。但是同樣需要溫度控制設備，因此限制了使用給地域和環境。

因此，亟需一種靈敏度高、不需要附加設備，儲存條件要求低，可在多種環境中檢測核酸的方法及試劑盒。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種基于電化學信號底物放大檢測核酸的方法，該方法通過在電極表面修飾核酸探針，然后與待測核酸樣品雜交后再經過夾心反應與鏈酶親和素化的核酸捕獲探針2雜交，最后通過生物素和鏈酶親和素之間的生物親和作用將生物素化的電化學酶結合到電極表面，催化無電化學活性的底物變為電化學活性產物，從而在電極上檢測；本發明的目的之二在于提供基于電化學信號檢測核酸的試劑盒。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

1、基于電化學信號底物放大檢測核酸的方法，包括如下步驟：

1)在傳感電極上修飾特異識別待測核酸的核酸探針；

2)將待測核酸片段通過微流控通道送至傳感電極處，與傳感電極上的核酸探針1互補配對結合；通入清洗溶液洗清洗，留下配對物質；然后與電化學酶標的核酸探針2結合，通入清洗溶液洗清洗；通入底液，使標記的電化學活性酶催化底物轉化為電化學活性物質，用電化學方法進行檢測；電化學信號可通過調高底液濃度或增長反應時間放大；

或者，首先將待測核酸片段用電化學酶標記，然后通過微流控通道送至傳感電極處，與傳感電極上的核酸探針1互補配對結合；通入清洗溶液洗清洗掉未配對物質與未反應的酶標，僅留下配對物質；通入底液，使標記的電化學活性酶催化底物轉化為電化學活性物質，用電化學方法進行檢測；電化學信號可通過調高底液濃度或增長反應時間放大。

本發明優選的，傳感監測的靈敏度和最低檢測限可由調節底物濃度或/和電化學反應時間實現調控。