[發明專利]一種核酸檢測方法及應用

在審

• 申請號: 202111444791.3
• 申請日: 2021-11-30
• 公開（公告）號: CN114317691A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 斯志娟;雷震
• 申請（專利權）人: 南昌市第九醫院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 何世磊

本發明提供了一種核酸檢測方法及應用，基于Rt?PCR核酸檢測高靈敏度，只要有靶核酸進入擴增反應體系，經過擴增放大后都能被檢出。因此，同時檢測管數越多，實際進入批分析的原始樣本量就越多，靶核酸被檢出的概率就越大。在高濃度區域，同時檢測多管只能用于觀察檢測的重復性；但在低濃度區域，每一個被檢出管都表示1段靶序列進入批分析體系，因此，可以根據被檢出管數進行定量。本發明采用批分析(多管同測)法對低濃度(載量)樣本進行核酸擴增檢測，實驗結果表明在面對低濃度(載量)樣本時，該方法能夠提高核酸檢測的靈敏度，達到更低的檢出限。

技術領域

本發明涉及醫學檢測技術領域，特別是涉及一種核酸檢測方法及應用。

背景技術

實時聚合酶鏈反應(Rt-PCR)應用于感染性疾病的診斷(病原體檢測)具有快速、簡便、準確、高通量等優勢。核酸檢測相關產業鏈的各個環節更是迅猛發展，但假陰性問題也一直困擾著疫情防控各方。臨床意義上的假陰性是指患者的臨床癥狀及影像學證據高度疑似新型冠狀病毒 (2019-nCoV)肺炎，而新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸檢測多次或始終為陰性。

引起假陰性的原因較多，包括試劑因素、檢測因素、采樣因素、貯存運送因素、疾病病程階段及病毒變異等，導致樣本中無病毒或病毒載量低于試劑的檢測下限。Rt-PCR具有較高的檢測靈敏度，只需1copy靶核酸進入Rt-PCR擴增體系，經過若干次循環擴增后，都能檢測到靶核酸擴增信息。但是受循環擴增體系條件的制約，實際進入擴增體系的原始樣本量大約為5-10μl，因此，試劑的實際檢出限也僅為200-100copies/mL。

此外，人類非自限性病毒感染性疾病的病因學治療手段有限，目前，大多依賴核苷(酸)類似物破壞病毒(逆)轉錄，干擾或終止病毒核酸的合成，達到抗病毒的作用。如HBV、HCV、HIV等。核苷酸類似物不能清除病毒，但可通過長期抑制病毒復制，耗盡病毒庫的方式，達到清除病毒的目的。核苷(酸) 類似物治療的理想停藥時機是體內病毒庫被耗盡，這就促使臨床對核酸檢測的靈敏度無限高的期望(檢測下限無限地接近于0)。研究證實，抗HBc陽性的隱匿性HBV感染的獻血者血液中含有0.15IU/ml的HBV DNA，即可導致受血者感染。當前臨床檢測技術采用磁珠法富集核酸，以提高原始樣本擴增量。數字PCR技術采用流體芯片或微滴技術等分配成單拷貝靶核酸擴增，通過計數陽性孔數目的方式進行核酸絕對定量檢測，但不能很好的應用在低濃度(載量) 樣本中。

因此，在面對低濃度(載量)樣本時，如何進一步提高核酸檢測的靈敏度，達到更低的檢出限是本領域技術人員需要解決的技術問題。

發明內容

鑒于上述狀況，本發明提供一種核酸檢測方法及應用，以在面對低濃度(載量)樣本時，進一步提高核酸檢測的靈敏度，達到更低的檢出限。

本發明的技術方案為：

一種核酸檢測方法，包括：

在Rt-PCR核酸檢測時，采用多管同測的批分析法增加實際進入擴增體系的樣本量。

上述核酸檢測方用于新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸的檢測。

其中，新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸的檢測包括以下步驟：

用細胞保存液將新型冠狀病毒全基因組假病毒質控品稀釋為1：10、1：100、 1：1000梯度濃度樣本，用新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸檢測試劑檢測上述梯度濃度樣本，各平行檢測三管；然后選擇三管均陽性的最低濃度(1：10)樣本再次倍比稀釋，形成系列梯度濃度樣本盤S1(1：10)、S2(1：20)、S3(1： 40)、S4(1：80)、S5(1：160)、S6(1：320)、S7(1：640)；

用新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸檢測試劑檢測梯度濃度樣本盤S1-S7，每批各濃度平行檢測6管，共檢測6批次，最終每個濃度得到6個批分析結果， 36個單管檢測結果，其中，單靶標基因陽性管數≥1的批次判斷為該靶標基因該批次陽性。