[發明專利]一種高純度熊去氧膽酸的制備方法

有效

• 申請號: 202111444669.6
• 申請日: 2021-11-30
• 公開（公告）號: CN114438046B
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發明（設計）人: 郭新艷;劉英梅;張秀華;劉飛;陳勉;鄭德強;張曉元;張寧;邵華榮;張小剛;張艷艷;袁丹丹;張宗磊
• 申請（專利權）人: 山東省藥學科學院
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P33/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京秉文同創知識產權代理事務所(普通合伙) 11859
• 代理人: 張文武;陳少麗

本發明提供了一種耐堿性7β?羥基類固醇脫氫酶(7β?HSDH)以及利用該耐堿性7β?HSDH酶進行制備高純度熊去氧膽酸的方法，屬于生物技術領域。所述耐堿性7β?HSDH酶的氨基酸序列與SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列相比，在SEQ?ID?No.1所述序列的第228位絲氨酸存在突變，所述第228位絲氨酸突變為苯丙氨酸或纈氨酸，所述方法包括利用該耐堿性7β?HSDH酶制備熊去氧膽酸的步驟。本申請提供的耐堿性酶以及利用該耐堿性酶制備熊去氧膽酸的方法，能夠顯著提高從原料7K?LCA轉化為熊去氧膽酸的轉化率，并且產品純度高，符合藥典的要求，即該方法能夠低污染、可持續、易工業化的獲得高質量的熊去氧膽酸。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其是一種高純度熊去氧膽酸的制備方法，還涉及制備高純度熊去氧膽酸的耐堿性酶。

背景技術

熊去氧膽酸(UDCA)的化學名稱為：3α,7β-二羥基-5β-膽甾烷-24酸，分子式為C₂₄H₄₀O₄，分子量392.58，白色結晶粉末，熔點200-203℃，無臭，易溶于乙醇、冰醋酸、氫氧化鈉試液，在三氯甲烷中不溶。

UDCA是一種無毒性親水膽汁酸，可以競爭性抑制毒性內源性膽汁酸在回腸中的吸收。通過激活Ca²⁺、蛋白激酶C組成的信號網絡，來激活分裂活性蛋白激酶，從而增強膽汁澉積肝細胞的分泌能力，使血液及肝細胞中的內源性疏水膽汁酸濃度下降，可用治療膽汁淤積行疾病。在臨床上，熊去氧膽酸主要用于溶解膽固醇型膽結石，原發性膽汁肝硬化PBC，慢性丙型肝炎，同時還用于酒精性肝病，非酒精性脂肪肝、良性復發性肝內膽汁淤積癥、先天性內膽管囊性擴張癥，是治療肝硬化的一線藥物，臨床上療效好，副作用小，應用廣泛，市場缺口大。

目前，國內外主要使用化學法以鵝去氧膽酸為原料經過氧化、還原兩步化學反應制備熊去氧膽酸，反應過程中使用氧化、還原劑和大量的溶劑，且鵝去氧膽酸轉化率較低，只有80％左右的鵝去氧膽酸轉化為熊去氧膽酸，后處理需要進行拆分，精制等過程，且產物中含有鵝去氧膽酸及其他雙氧化物雜質很難除掉，對產品質量影響很大，目前市售的熊去氧膽酸純度不高。

綠色酶催化工藝這幾年蓬勃發展，但是受制于原料7K-LCA在弱堿性水溶液中的溶解度有限，生物酶對有機溶劑的耐受度差，穩定性差及工作pH與反應體系不相容等共同缺陷，使生物法合成UDCA轉化效率低，產品雜質多無法滿足藥典要求，難以實現產業化生產。

并且，原料3α-羥基-7-氧代-5β-膽烷酸即7K-LCA，在中性溶劑中的溶解度低，較低的溶解度直接導致反應效率難以提升。而7K-LCA在偏堿性溶液中的溶解度高，但是在利用酶轉化方法制備時，堿性越強，酶的活力越差，反應效率仍難以提升。

現有技術中提供了一些利用酶轉化7k-LCA制備熊去氧膽酸的方法，例如CN107980064A、CN105861613A、CN106520888A和CN108251491A等。然而，包括上述專利的現有技術均未能關注熊去氧膽酸相關酶的耐堿性，因此熊去氧膽酸的提取效率和純度均難以進一步提高。

發明內容

為了解決上述問題，本發明旨在提供一種用于制備高純度熊去氧膽酸的耐堿性酶，以及利用耐堿性酶高效轉化7K-LCA制備熊去氧膽酸的方法，使得制備出的熊去氧膽酸產品純度達到99.5％以上，ee值95％，單雜含量小于0.5％，符合藥典的要求。

一方面，本申請提供了一種耐堿性7β-HSDH酶，所述耐堿性7β-HSDH酶的氨基酸序列與SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列相比，在SEQ?ID?No.1所述序列的第228位絲氨酸存在突變，所述第228位絲氨酸突變為苯丙氨酸或纈氨酸。

另一方面，本申請還提供了編碼上述耐堿性7β-HSDH酶的核酸。