[發明專利]一種高純度熊去氧膽酸的制備方法

有效

• 申請號: 202111444669.6
• 申請日: 2021-11-30
• 公開（公告）號: CN114438046B
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發明（設計）人: 郭新艷;劉英梅;張秀華;劉飛;陳勉;鄭德強;張曉元;張寧;邵華榮;張小剛;張艷艷;袁丹丹;張宗磊
• 申請（專利權）人: 山東省藥學科學院
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P33/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京秉文同創知識產權代理事務所(普通合伙) 11859
• 代理人: 張文武;陳少麗

1.一種耐堿性7β-HSDH酶，其特征在于，所述耐堿性7β-HSDH酶的氨基酸序列與SEQ?IDNo.1所示氨基酸序列相比，所述序列僅將第228位絲氨酸突變為苯丙氨酸或纈氨酸。

2.編碼如權利要求1所述的耐堿性7β-HSDH酶的核酸。

3.一種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含如權利要求2所述的核酸。

4.根據權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體的骨架載體包括pET-22b。

5.一種宿主細胞，其特征在于，包含如權利要求2的核酸，或如權利要求3或4所述的重組表達載體。

6.根據權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞是大腸桿菌。

7.根據權利要求6所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞是大腸桿菌BL21(DE3)。

8.一種制備高純度熊去氧膽酸的方法，其特征在于，所述方法包括利用如權利要求1所述的耐堿性7β-HSDH酶制備熊去氧膽酸的步驟。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

步驟一：利用所述的耐堿性7β-HSDH酶以及葡萄糖脫氫酶GDH和輔酶NADPH將7K-LCA轉化為熊去氧膽酸，獲得轉化液；

步驟二：將所述轉化液升溫并加入絮凝劑使蛋白質絮凝沉降，濃縮后調至酸性，獲得熊去氧膽酸粗品；

步驟三：將所述熊去氧膽酸粗品溶解并進行硅烷化純化，經過濾、洗滌、干燥后，即獲得所述高純度熊去氧膽酸。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖脫氫酶GDH通過以下方法獲得：

將篩選獲得的來源于枯草芽孢桿菌的GDH酶基因序列在大腸桿菌中進行重組表達，經發酵培養、分離純化獲得具有耐堿性的GDH酶。

11.根據權利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述步驟一還包括將7K-LCA與醇溶劑、緩沖液、葡萄糖混合的步驟。

12.根據權利要求11所述的制備方法，其特征在于，所述醇溶劑選自甲醇、乙醇、叔丁醇、異丙醇中的一種或多種。

13.根據權利要求11所述的制備方法，其特征在于，所述緩沖液為Tris-HCl緩沖溶液。

14.根據權利要求11所述的制備方法，其特征在于，混合后控制7K-LCA的終濃度為10~30mM，7β-HSDH酶的酶活反應終濃度為8~30UmL^-1，GDH酶的酶活反應終濃度為3~10UmL^-1，輔酶NADPH的終濃度為0.1~1mM，葡萄糖終濃度為10~30mM。

15.根據權利要求14所述的制備方法，其特征在于，混合后控制7K-LCA的終濃度為15~25mM，7β-HSDH酶的酶活反應終濃度為10~20UmL^-1，GDH酶的酶活反應終濃度為5~8UmL^-1，輔酶NADPH的終濃度為0.3~0.6mM，葡萄糖終濃度為15~25mM。

16.根據權利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述轉化的條件為：溫度35-38℃，pH為8~10，轉化時間2~5小時。

17.根據權利要求16所述的制備方法，其特征在于，所述轉化的條件中pH為8.5~9.0。