[發明專利]一種CadR基因突變體、含突變體的重組載體及其應用

有效

• 申請號: 202111435335.2
• 申請日: 2021-11-29
• 公開（公告）號: CN114369606B
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發明（設計）人: 陳少鵬;蔡葉申;朱凱麗;沈亮
• 申請（專利權）人: 中國科學院合肥物質科學研究院;皖南醫學院
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C12N15/65;C12N1/21;C07K14/21;G01N21/64;C12R1/19
• 代理公司: 合肥市長遠專利代理事務所(普通合伙) 34119
• 代理人: 余婧

本發明公開了一種CadR基因突變體，具有如SEQ?ID?NO:6所示的核苷酸序列，或與其互補的核苷酸序列。本發明的CadR基因突變體對鎘有更高的響應靈敏度和特異性，含上述CadR基因突變體的重組載體及其工程菌作為鎘誘導型生物傳感器能夠提升檢測靈敏度，同時削弱其他重金屬對傳感器檢測的影響，可以對安全標準范圍內的鎘進行檢測；作為重組蛋白的表達載體能夠以微量的鎘作為誘導劑誘導目的蛋白的表達；其在鎘污染監測和調控蛋白表達方面都具有應用價值。

技術領域

本發明涉及生物傳感及環境污染物檢測技術領域，尤其涉及一種CadR基因突變體、含突變體的重組載體及其應用。

背景技術

鎘污染作為一項重要的環境風險因素，因其能在土壤及水體中快速積累并最終通過食物鏈進入人體且對人體產生嚴重健康危害而被廣泛關注。因此，環境中鎘的檢測顯得尤為重要并被視作衡量環境污染程度的一種標準，現有的原子吸收光譜(AAS)、電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)等傳統理化方法存在樣品處理過程復雜、檢測成本高、易產生有害副產物等缺點。

細菌由于其種群豐富度高、生長快速、成本低、易于培養以及其獨特的基因操作能力等優勢使其成為生物檢測的理想選擇。全菌生物傳感器是以合適的細菌為底盤微生物，通過構建污染物響應及信號放大系統來針對環境中的特定污染物作出響應并輸出信號的生物傳感模式。全菌生物傳感器一般由響應元件及報告元件構成，對于重金屬離子的全菌生物傳感器而言，其主要的工作機理是，能特異性識別重金屬的響應元件(一般為金屬結合蛋白)在識別到外界環境中的重金屬離子后，能夠與報告模塊中其特異性結合的啟動子結合或脫落，這時啟動子后的報告基因便會啟動表達，通過檢測報告基因的表達便可實現整個通路的信號檢測，即報告基因信號的表達量反映了環境中重金屬離子的濃度，通過這樣一條信號識別及輸出通路即可使用全菌生物傳感器來實現重金屬離子的檢測，利用合成生物學的方法通過替換不同重金屬的特異性響應元件對通路進行改造理論上可以完成對不同重金屬的特異性識別與檢測。但是，由于大多數金屬結合蛋白在作為響應元件時其特異性較差，同家族的金屬結合蛋白往往對多種重金屬離子均具有結合能力，難以形成針對特定重金屬離子響應的專一性，此外，細菌體內的蛋白表達效率以及信號通路的信號放大程度等都限制了重金屬全菌生物傳感器的開發，導致目前開發的重金屬全菌生物傳感器仍具有靈敏度差、特異性低的問題，這也限制了重金屬全菌生物傳感器在實際環境樣品檢測中的應用。

因此，為了使生物傳感器能夠實際應用于鎘含量的檢測，如何提高其針對鎘的特異性以及靈敏度成為關鍵問題，而構建在低濃度鎘條件下具有高表達水平的鎘敏感元件有助于解決這一問題。此外，由于在重組蛋白的表達中目前應用最廣泛的是E.coli的原核表達系統，而該系統在表達重組蛋白的過程中存在表達速度過快、肽鏈的非正確折疊以及多肽鏈的疏水區存在相互作用等問題，這導致所表達的重組蛋白多以包涵體的形式存在，而無法滿足獲得可溶性蛋白的需求，并且E.coli表達系統通常需要以IPTG誘導重組蛋白的表達，而IPTG?的價格較昂貴，在大體積的生產發酵中使用IPTG也會使成本增加。鎘敏感元件的構建可以通過添加微量鎘作為誘導劑來誘導目的蛋白的表達，為實現對目的蛋白表達水平進行有效調控提供了一條可行性的途徑。

發明內容

基于背景技術存在的技術問題，本發明提出了一種CadR基因突變體、含突變體的重組載體及其應用。

本發明提出的一種CadR基因突變體，所述基因突變體具有如SEQ?ID?NO:6?所示的核苷酸序列，或與其互補的核苷酸序列。

一種含所述的CadR基因突變體的重組載體，所述重組載體中還含有組成型啟動子、pCadR啟動子和目的基因，所述組成型啟動子與CadR基因突變體可操作性地連接，且CadR基因突變體位于組成型啟動子下游，所述pCadR啟動子與目的基因可操作性地連接，且目的基因位于pCadR啟動子下游。

其中，CadR基因是鎘特異性響應蛋白CadR的編碼基因，pCadR啟動子是CadR?特異性啟動子。