[發明專利]動態交聯水凝膠培養細胞的應用

在審

• 申請號: 202111429199.6
• 申請日: 2021-11-29
• 公開（公告）號: CN115558634A
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發明（設計）人: 邊黎明;楊伯光;徐夏憶
• 申請（專利權）人: 海諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/078;A61K9/00;A61K9/06;A61K35/17;A61K35/545;A61K47/40;A61K47/42;A61L27/20;A61L27/22;A61L27/38;A61L27/50;A61L27/52
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

本發明涉及一種動態交聯水凝膠的應用。所述動態交聯水凝膠具體地由明膠和交聯基團修飾的環糊精混合形成的水凝膠預聚體，混入胚胎干細胞或免疫細胞后，在交聯引發劑或紫外光的作用下發生交聯反應得到的動態交聯水凝膠。所述水凝膠在無需飼養層細胞或分化抑制劑的基礎培養基中長期培養胚胎干細胞并保持其干性，操作簡單，適宜規模化培養。負載有免疫細胞的水凝膠可直接應用于生物體內的注射和填充。

技術領域

本發明涉及組織工程技術領域，更具體的說，涉及一種動態交聯水凝膠在3D培養細胞中的應用。

背景技術

由于細胞聚集團簇被廣泛應用于藥物篩選體外模型、疾病進展和發育生物學的基礎研究以及自體或異體器官培植和組織再生的臨床研究領域等等，因此利用水凝膠對細胞團簇進行增殖培養、細胞學研究、細胞釋放收集及作為組織工程支架裝載細胞用于組織再生等具有重大生物醫學意義和應用前景。

現有技術在體外培養細胞中，對那些成團生長的細胞，如何在培養過程中抑制分化仍是一個重要的因素。例如，在胚胎干細胞的增殖培養中，為抑制其分化可使用經紫外線照射后停止分裂的小鼠胚胎成纖維細胞作為飼養細胞。胚胎干細胞(ESCs)是一種典型的成團培養細胞系。一般而言，ESCs的常規二維(2D)培養需要與小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)即飼養層細胞或培養基補充劑如GSK3β和Mek1/2抑制劑(簡稱2i)共培養，以抑制自發分化。然而，在長期培養中保持ESCs處于未分化狀態仍然具有挑戰性。更重要的是，與體外在二維表面上培養的ESCs不同，在胚胎發育期間，內部細胞團里的細胞是與三維(3D)的細胞外基質(ECM)相互作用，后者能調節ESCs的自我更新和分化。細胞和周圍ECM之間的相互作用對于胚胎干細胞增殖、干性維持、定向分化和器官形成至關重要。但是上述二維培養細胞的方法中，無論是使用飼養層細胞的方式，還是采取加入分化抑制劑的方法，在培養過程中維持未分化狀態僅可持續數日，還沒有一種可長期支持細胞團簇生長的方法。

三維生物材料支架，如水凝膠，有望在沒有飼養層且不需要頻繁傳代培養的情況下輔助胚胎干細胞的長期培養。雖然已經有大量關于水凝膠體系應用于體外細胞三維培養的研究，但是這些工作還存在一些有待解決的問題。現有的體外培養胚胎干細胞的方法無法得到較大、尺寸均一團簇的細胞克隆，同時在長時間培養過程中，難以保持胚胎干細胞的干性。馮茜等人報道了一種基于明膠的主客體超分子組裝水凝膠在培養間充質干細胞中的應用，在14天內，間充質干細胞分化為星型骨細胞，并可注射于小鼠的關節部位。但是沒有報道該水凝膠可長期三維培養胚胎干細胞，同時保持其干性。

隨著免疫治療的快速發展，免疫細胞的體外培養也日益得到研究人員的重視。傳統的免疫細胞培養采用二維培養或懸浮培養的方式，為得到好的細胞增殖效果，往往添加各種輔助試劑，例如分化抑制劑，懸浮培養時往往需要防止細胞沉積的添加物等。部分培養方法獲得的細胞生長不均一，受生長環境和實驗操作的影響較大，不適宜規模化的培養。

發明內容

本申請的目的之一是提供一種基于明膠的動態交聯水凝膠在體外培養細胞中的應用。所述動態交聯水凝膠，是由明膠和交聯基團修飾的環糊精混合形成的水凝膠預聚體，在交聯引發劑或光照下發生交聯反應得到的動態交聯水凝膠；其中所述細胞為胚胎干細胞或免疫細胞。

在一種優選的實施方式中，所述交聯基團修飾的環糊精是丙烯酸酯化環糊精，在某些實施方式中，所述丙烯酸酯化環糊精是β-環糊精。

在一種實施方式中，所述水凝膠的制備方法，包括如下步驟：

1)丙烯酸酯化β-環糊精制備步驟：

將β-環糊精溶解于二甲基甲酰胺(DMF)得到1-10％(w/v)的β-環糊精/DMF溶液，以0.75-7.5％(v/v)比例加入三乙胺，將體系溫度降至0℃；向體系中逐滴加入環糊精摩爾量4-8倍量的丙烯酰氯，滴加結束后持續攪拌12小時，抽濾除去三乙胺鹽酸鹽，獲得澄清溶液即反應產物；通過真空旋轉蒸發濃縮反應產物，將反應產物濃縮液滴加到丙酮中得到白色沉淀，并將所得到的白色沉淀用丙酮洗滌，最后真空干燥得到丙烯酸酯化β-環糊精(Ac-CD)；