[發(fā)明專利]一種精確鑒定草麻黃的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202111423266.3 | 申請日： | 2021-11-26 |
| 公開（公告）號： | CN114058730A | 公開（公告）日： | 2022-02-18 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 崔晉龍;蔣珊 | 申請（專利權(quán)）人： | 山西大學(xué) |
| 主分類號： | C12Q1/6895 | 分類號： | C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11 |
| 代理公司： | 山西五維專利事務(wù)所(有限公司) 14105 | 代理人： | 張福增 |
| 地址： | 030006 山*** | 國省代碼： | 山西;14 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 精確 鑒定 麻黃 方法 | ||
本發(fā)明提供了一種精確鑒定草麻黃的方法。具體是利用設(shè)計(jì)、篩選獲得的引物，擴(kuò)增并采用Sanger測序方法獲得葉綠體基因rbcL及matK目的序列，通過與GenBank數(shù)據(jù)庫比對，并計(jì)算遺傳距離結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育及特征核苷酸位點(diǎn)分析，區(qū)分草麻黃與其他物種的方法。步驟為：提取草麻黃植物基因組DNA，利用PCR技術(shù)，采用給定引物及程序擴(kuò)增，并采用Sanger測序獲得葉綠體基因rbcL和matK的目的序列，采用CExpress、Bioedit及MEGA 5.1等軟件將草麻黃與麻黃屬近緣物種進(jìn)行多序列比對，分析得到穩(wěn)定的種間遺傳變異位點(diǎn)，并以K2P模型計(jì)算它們的種內(nèi)種間遺傳距離，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，綜合分析以鑒別草麻黃與同屬近緣物種。該方法具有穩(wěn)定、高效、精確的特點(diǎn)，是從分子水平鑒定草麻黃植物和藥材的良好方法。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于藥用植物物種鑒定，具體的說是涉及采用rbcL+matK組合條形碼精確鑒別草麻黃與其他相似物種的方法。
背景技術(shù)
草麻黃(Ephedra sinica Stapf)，別名麻黃草、華麻黃、無葉草等，為麻黃屬草本狀灌木植物，是中華人民共和國《藥典》收錄的中藥“麻黃”及“麻黃根”指定的主要基原植物。用途廣、用量大，是我國許多經(jīng)典名方的主要成分。
全世界麻黃屬下有67個(gè)相似種，我國有15個(gè)種及4個(gè)變種，主要產(chǎn)于遼寧、吉林、內(nèi)蒙古、河北、山西、河南西北部及陜西等省區(qū)，適應(yīng)性強(qiáng)，常組成大面積的單純?nèi)郝洹＝陙恚萋辄S市場需求量逐年上升，存在以次充好、物種混淆使用的現(xiàn)象，但市場上尚沒有精確鑒定并區(qū)分草麻黃與其他相似物種的良好方法，這很大程度上限制了草麻黃用藥安全及其現(xiàn)代化應(yīng)用研究。
截止目前，草麻黃的鑒別多采用兩種方法，一種是傳統(tǒng)的形態(tài)鑒別法，該方法主要從植物外觀、顏色、理化性質(zhì)等指標(biāo)區(qū)分，存在誤差大、不夠精密等缺點(diǎn)；第二種方法，是通過核糖體基因ITS、葉綠體chlB全基因、限制性片段長度多態(tài)性等分子生物學(xué)的方法分析，僅可以區(qū)分草麻黃與個(gè)別物種，或麻黃基原物種與其他物種，但無法精密而嚴(yán)格地區(qū)分草麻黃與木賊麻黃、中麻黃、膜果麻黃、山嶺麻黃等眾多同屬近緣物種！而且這些方法存在成本高、操作步驟繁瑣、樣本分析規(guī)模較小等缺點(diǎn)。
本發(fā)明則通過開發(fā)物種間特異的matK條形碼，并聯(lián)合使用rbcL通用條形碼對草麻黃進(jìn)行鑒定，實(shí)現(xiàn)了草麻黃物種的精密鑒定。具有物種區(qū)分度高，操作方便、檢測高效、結(jié)果可信等很多優(yōu)點(diǎn)，是一種很有應(yīng)用前景的方法技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為鑒定草麻黃植物及藥材提供matK基因特異性引物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供采用通用引物擴(kuò)增rbcL基因目的序列，以及采用上述引物擴(kuò)增matK基因目的序列，將二者綜合分析以鑒定草麻黃植物及藥材的方法。
本發(fā)明提供及使用的引物，具體見表1
表1.草麻黃鑒定引物
本發(fā)明提供一種利用rbcL+matK組合條形碼鑒定草麻黃的方法，步驟如下：
1)準(zhǔn)備草麻黃植物干或者濕的樣品；
2)基因組DNA提取：采用常規(guī)方法提取草麻黃植物的基因組DNA；
3)采用表1中rbL通用引物，PCR擴(kuò)增葉綠體基因rbL目的序列；采用25μL PCR體系：2×SanTaq PCR Master Mix 12.5μL,引物各1μL(10μmol/L),模板DNA 2μL(100ng/μL),ddH2O 8.5μL；擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性50s,55℃退火1min，72℃延伸1min，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；
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