[發(fā)明專利]一種精確鑒定草麻黃的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111423266.3
• 申請日: 2021-11-26
• 公開（公告）號: CN114058730A
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發(fā)明（設計）人: 崔晉龍;蔣珊
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司) 14105
• 代理人: 張福增

1.一種草麻黃matK基因引物對，其特征在于，正向引物核苷酸序列為CTATGTTATAGATCCGAATC，反向引物核苷酸序列為CAACTTTTCCATCGAAGAG。

2.一種利用rbcL+matK組合條形碼鑒定草麻黃的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)準備草麻黃植物干或者濕的樣品；

2)采用常規(guī)方法提取草麻黃植物的基因組DNA；

3)采用rbL通用引物ATGTCACCACAAACAGAAAC和TCGCATGTACCTGCAGTAGC，PCR擴增葉綠體基因rbL目的序列；采用25μL PCR體系：2×SanTaq PCR Master Mix 12.5μL,濃度為10μmol/L的引物各1μL,濃度為100ng/μL的模板DNA 2μL,ddH₂O 8.5μL；擴增反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性50s,55℃退火1min，72℃延伸1min，36個循環(huán)；72℃延伸10min；

4)采用正向引物CTATGTTATAGATCCGAATC和反向引物CAACTTTTCCATCGAAGAG，PCR擴增葉綠體基因matK目的序列；采用25μL PCR體系：2×SanTaq PCR Master Mix 12.5μL,濃度為10μmol/L的引物各0.5μL,濃度為100ng/μL的模板DNA 2μL,ddH2O 8.5μL；擴增反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s,52℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min；

5)采用常規(guī)方法進行瓊脂糖凝膠電泳，確認PCR擴增產物；

6)采用Sanger方法雙向測序；

7)采用CExpress軟件拼接序列，并利用Bioedit及MEGA 5.1軟件將麻黃屬近緣物種進行多序列比對，分析得到穩(wěn)定的種間遺傳變異位點；以Kimura-2-parameter模型計算它們的種內種間遺傳距離，進行“barcoding gap”分析；隨后以鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用Bootstrap1000次重復檢驗各分支的支持率，并選擇保留50％含有空位的列，以相關類群即與麻黃目同一買麻藤亞綱(Gnetidae)下買麻藤屬(Gnetum Linn)下模式種-顯軸買麻藤Gnetum gnemon為Outgroup，綜合分析以鑒別草麻黃與同屬近緣物種。

3.如權利要求1所述的草麻黃matK基因引物對在鑒定草麻黃中的應用。