[發明專利]催化活性提高的L-山梨酮脫氫酶突變體

有效

• 申請號: 202111420059.2
• 申請日: 2021-11-26
• 公開（公告）號: CN113913400B
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發明（設計）人: 周景文;李冬;陳玥;李江華;陳堅;曾偉主
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/60;C12P17/04;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了催化活性提高的L?山梨酮脫氫酶突變體，屬于基因工程和酶工程技術領域。本發明以氧化葡萄糖酸桿菌來源的L?山梨酮脫氫酶為出發序列，通過定點突變獲得了酶活提升的L?山梨酮脫氫酶突變體M167L、S453A、L460V、E471D和M167L?S453A?E471D，使突變體的比酶活達4.20U/mg、1.67U/mg、3.00U/mg、1.73U/mg、2.82U/mg，與野生酶相比提高了1.1～2.6倍，有助于實現L?山梨酮脫氫酶參與的代謝途徑相關產物產量的提高。

技術領域

本發明涉及催化活性提高的L-山梨酮脫氫酶突變體，屬于基因工程和酶工程技術領域。

背景技術

維生素C，又稱抗壞血酸，是人體必須的一種維生素。廣泛應用于食品、飲料、制藥、化妝品和飼料領域。2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)是生產維生素C的直接前體物質。目前工業生產2-KLG利用三菌兩步發酵法。和一步發酵相比，三菌兩步發酵法具有高能耗、高物耗、混菌發酵難以精確調控和育種困難等劣勢。探索一步發酵生產2-KLG成為了研究者的共同目標。由于從山梨醇生產2-KLG只涉及3個酶的催化過程，分別為D-山梨醇脫氫酶、L-山梨糖脫氫酶和L-山梨酮脫氫酶。因此，目前研究者大多通過代謝工程進行一步菌的研究。主要方法是將2-KLG合成途徑中關鍵酶基因進行異源表達進行2-KLG的生產，但效果并不能和工業化媲美。YOSHIMASA SAITO于1997年通過對菌株進行誘變，得到了一株利用山梨醇高產2-KLG的菌株，但是由于信息提供不足，無法得到重復。

發明內容

發明人前期通過篩選獲得了一株可以直接將D-山梨醇轉化為2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)的氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)WSH-004，并鑒定了其中的L-山梨糖脫氫酶與L-山梨酮脫氫酶。本發明通過基因工程和酶工程的手段，制備出了酶活性提高的L-山梨酮脫氫酶。

本發明提供了具有酶活提高的L-山梨酮脫氫酶的突變體，以來源于氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)WSH-004的L-山梨酮脫氫酶為出發序列，對第167、453、460和471位的氨基酸中的一個或多個進行取代，所獲得的突變體與野生型L-山梨酮脫氫酶相比，酶活提升。

在一種實施方式中，所述出發序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一種實施方式中，所述突變體是將第167位置的甲硫氨酸(Met)變成亮氨酸(Leu)，突變體命名為M167L，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一種實施方式中，所述突變體是將第453位置的絲氨酸(Ser)變成丙氨酸(Ala)，突變體命名為S453A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一種實施方式中，所述突變體是將第460位置的亮氨酸(Leu)變成纈氨酸(Val)，突變體命名為L460V，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。在一種實施方式中，所述突變體是將第471位置的谷氨酸(Glu)變成天門冬氨酸(Asp)，突變體命名為E471D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在一種實施方式中，所述突變體是將第167位置的甲硫氨酸(Met)變成亮氨酸(Leu)，將第453位置的絲氨酸(Ser)變成丙氨酸(Ala)，將第471位置的谷氨酸(Glu)變成天門冬氨酸(Asp)，突變體命名為M167L-S453A-E471D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本發明還提供了編碼所述突變體的基因。

在一種實施方式中，編碼突變體M167L的核苷酸序列是在SEQ ID NO.7的基礎上將第167位密碼子由AUG替換為CUC。

在一種實施方式中，編碼突變體S453A的核苷酸序列是在SEQ ID NO.7的基礎上將第453位密碼子由AGC替換為GCG。