[發(fā)明專利]一種包載microRNA的外泌體的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202111419096.1
• 申請日: 2021-11-26
• 公開（公告）號: CN114085817A
• 公開（公告）日: 2022-02-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李海源;盧俊鋒
• 申請（專利權(quán)）人: 三代康年（上海）醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/113;A61K31/7088;A61K35/28;A61K9/72;A61K47/46;A61P11/00;A61P29/00
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 陳小龍

1.一種包載microRNA的外泌體的制備方法，其特征在于，所述包載microRNA的外泌體的制備方法包括：

(1)分離并培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，將間充質(zhì)干細(xì)胞與電轉(zhuǎn)工作液混合，得到混合液，將microRNA母液與混合液混合，得到預(yù)轉(zhuǎn)染溶液；

(2)將步驟(1)中所述預(yù)轉(zhuǎn)染溶液進(jìn)行電轉(zhuǎn)處理；

(3)培養(yǎng)電轉(zhuǎn)處理后的間充質(zhì)干細(xì)胞，得到培養(yǎng)液；

(4)從所述培養(yǎng)液中收集所述包載microRNA的外泌體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包載microRNA的外泌體的制備方法，其特征在于，步驟(1)具體包括：

使用消化液對組織進(jìn)行消化和培養(yǎng)，得到間充質(zhì)干細(xì)胞懸液，并且離心處理得到間充質(zhì)干細(xì)胞，將間充質(zhì)干細(xì)胞與電轉(zhuǎn)工作液混合，得到混合液，將microRNA母液與混合液混合，得到預(yù)轉(zhuǎn)染溶液；

優(yōu)選地，所述消化液為0.05～0.2％的胰蛋白酶消化液；

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)的時間為30～36h；

優(yōu)選地，所述離心處理的溫度為0～8℃，離心處理轉(zhuǎn)速為1100～1200rpm，離心處理時間為5～8min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的包載microRNA的外泌體的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述混合液添加的總RNA的濃度為0.192～2.88μg/μL；

優(yōu)選地，所述microRNA母液總RNA濃度為3.2～4.8μg/μL；

優(yōu)選地，所述microRNA母液包括hsa-mir-218-1、hsa-mir-365a、hsa-mir-29a或hsa-mir-324-5p中的任意一種或至少兩種的組合；

優(yōu)選地，所述microRNA母液中hsa-mir-218-1、hsa-mir-365a、hsa-mir-29a和hsa-mir-324-5p的比例為(4～5):(1～3):(2～3):1；

優(yōu)選地，所述microRNA母液與混合液混合的體積比為3:(400～600)；

優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞包括脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的包載microRNA的外泌體的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述電轉(zhuǎn)處理的電壓為200～220V，電轉(zhuǎn)處理的電擊時長為4～6s，電轉(zhuǎn)處理的脈沖長度為20～25ms；

優(yōu)選地，步驟(3)所述培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)的時間為20～24h。

5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的包載microRNA的外泌體的制備方法，其特征在于，步驟(4)具體包括：

將培養(yǎng)液依次進(jìn)行一次離心、二次離心和三次離心，得到所述包載microRNA的外泌體；

優(yōu)選地，所述一次離心的溫度為0～8℃，一次離心的轉(zhuǎn)速為1800～2200rpm，一次離心的時間為15～30min；

優(yōu)選地，所述二次離心的溫度為0～8℃，二次離心的轉(zhuǎn)速為2500～3500rpm，二次離心的時間為30～40min；

優(yōu)選地，所述三次離心的溫度為0～8℃，三次離心的轉(zhuǎn)速為11000～15000rpm，三次離心的時間為50～60min。

6.一種由權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的包載microRNA的外泌體的制備方法制備得到的包載microRNA的外泌體。

7.一種外泌體組合物，其特征在于，所述外泌體組合物包含權(quán)利要求6所述的包載microRNA的外泌體和間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的外泌體組合物的制備方法，其特征在于，所述外泌體組合物的制備方法包括：

按權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的包載microRNA的外泌體的制備方法中的步驟(1)和步驟(2)制備電轉(zhuǎn)處理的間充質(zhì)干細(xì)胞，將所述電轉(zhuǎn)處理的間充質(zhì)干細(xì)胞加入到未經(jīng)電轉(zhuǎn)處理的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液中混合培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液，收集外泌體組合物；

優(yōu)選地，所述混合培養(yǎng)的時間為20～24h。