[發明專利]H1-pHSP65納米疫苗及其制備方法和用途

在審

• 申請號: 202111416905.3
• 申請日: 2021-11-25
• 公開（公告）號: CN114099639A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 楊潔;柴大飛;鄭駿年;姚宏;劉玲
• 申請（專利權）人: 徐州醫科大學
• 主分類號: A61K38/16
• 分類號: A61K38/16;A61K47/69;A61P35/00;B82Y5/00;B82Y40/00;C12N15/31;C12N15/70
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

本發明涉及疫苗制備技術領域，具體公開了H1?pHSP65納米疫苗及其制備方法和用途，通過pHSP65質粒的構建，進一步制備獲得H1?pHSP65納米疫苗，具體是將H1納米載體包裹HSP65質粒DNA形成H1?pHSP65納米顆粒。本發明制備的H1?pHSP65納米顆粒能夠用于制備抗腫瘤藥物，能夠抑制腫瘤細胞的增殖和轉移，能夠有效激發小鼠的腫瘤免疫反應。

技術領域

本發明屬于疫苗制備技術領域，具體涉及H1-pHSP65納米疫苗及其制備方法和用途。

背景技術

DNA疫苗在腫瘤疫苗中占有重要地位，是近年研究的熱點之一。腫瘤DNA疫苗是利用基因工程技術將腫瘤相關抗原的基因負載到質粒載體上，借助載體或者人體基因表達系統，能持續引起較強的體液免疫和細胞免疫，達到預防和治療疾病的目的。

HSP65(heat shock protein 65kD)是來源于卡介苗的熱休克蛋白，是卡介苗的主要抗原之一，國際基因庫登錄號是M17705?？ń槊缭缭?0年代即通過BCG膀胱內灌注用于淺表性膀胱癌的臨床治療，不僅可消滅原位癌，還可以預防腫瘤復發。但是，BCG的成分復雜，會引起一系列的毒副作用。許多腫瘤會過量表達和分泌HSP60蛋白，HSP60與腫瘤的發生、發展、轉移有關，可以作為腫瘤靶標之一，但是內源性HSP60的免疫原性較差。HSP65是HSP60家族成員，與HSP60具有高度同源性(高于55％)。HSP65具有多重的T表位和B表位，具有強免疫原性，能刺激機體同時產生體液免疫和細胞免疫。

但是，核酸分子量較大、帶負電等性質導致裸露DNA很難自主進入細胞，并且體內易降解，不能有效突破內皮細胞在血管腔內形成屏障，不能進入血管外的免疫細胞，從而阻礙特異性免疫反應的誘導。

納米載體H1(PEI₆₀₀-CyD-FA)是將陽離子聚合物聚乙烯亞胺PEI₆₀₀通過環糊精CyD修飾和偶合葉酸FA配體修飾后得到的新型納米復合物。H1不僅具有低毒、低免疫原性、水溶性好、生物相容性好的特點，可與帶負電荷的細胞膜或質粒DNA通過靜電天然吸附，具有增強細胞黏附吸收作用，促進胞間運輸、緩釋、基因轉染效率高等多種良好特性；還能引起高水平的DC對抗原的攝取作用和更強的抗原交叉遞呈作用，能顯著提高抗原特異性CTL活性，增強抗原特異性的體液免疫及細胞免疫應答。由于H1具有DNA結合能力強、載體轉染效率高、基因表達能力高、安全低毒等特點，適合作為基因疫苗的遞呈載體。

發明內容

本發明的目的是提供了H1-pHSP65納米疫苗及其制備方法和用途，通過熱休克蛋白65/HSP65(國際基因庫登錄號是M17705)的基因聯合H1(PEI₆₀₀-CyD-FA)納米載體構建獲得H1-pHSP65納米疫苗，制備得到的H1-pHSP65納米疫苗能夠用于制備抗腫瘤藥物，能夠更有效的被機體吸收，增強其免疫原性。

本發明提供了H1-pHSP65納米疫苗的制備方法，具體包括如下步驟：

S1，pHSP65質粒的構建：根據HSP65序列設計引物，擴增得HSP65序列，以pcDNA3.1為真核表達載體構建得pHSP65質粒；

S2，H1-pHSP65納米疫苗的制備：將質粒pHSP65轉化入DH5a大腸桿菌感受態細胞，培養后提取質粒，將pHSP65質粒和H1納米載體分別溶于PBS，靜置5分鐘后混合，靜置10分鐘后即得H1-pHSP65納米疫苗。

進一步地，S1中，所述引物包括F引物和R引物；

所述F引物的基因序列如SEQ ID NO.1所示；

所述R引物的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

進一步地，S2中，質粒pHSP65轉化入DH5a大腸桿菌感受態細胞后培養溫度為37℃。