[發明專利]一種生物傳感器及其制備方法和應用、檢測ctDNA的電化學系統

有效

• 申請號: 202111414807.6
• 申請日: 2021-11-25
• 公開（公告）號: CN114088783B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發明（設計）人: 趙卉;李燦鵬;張亞平;劉鳳
• 申請（專利權）人: 云南大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26;G01N27/30;G01N27/327
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 霍苗

1.一種生物傳感器，其特征在于，包括基底電極和依次負載在所述基底電極表面的Au-CP1探針層、巰基乙醇層、CRSPR/Cas12a體系層和CP2探針/磁性共價有機骨架/Pd-Au/MB層；

所述CRSPR/Cas12a體系層包括crRNA、Cas12a、ssDNA和待檢樣品；

轉錄所述crRNA的模板核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述Au-CP1探針層中的CP1探針的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述CP1探針在所述SEQ ID No.5序列的5'位有巰基修飾；

所述CP2探針/磁性共價有機骨架/Pd-Au/MB層包括磁性共價有機骨架和負載在所述磁性共價有機骨架的孔隙結構中的Pd-Au和MB，還包括與所述Pd-Au中的Au通過金硫鍵鍵合的CP2探針；

所述CP2探針核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述CP2探針在所述SEQ ID No.6序列的3'位有巰基修飾；

所述Pd-Au為類似銀耳狀結構的三維納米片。

2.如權利要求1所述的生物傳感器，其特征在于，所述待檢樣品為對血液樣本依次進行提取和RPA等溫擴增得到；

所述RPA等溫擴增的引物對為RPA-F和RPA-R；

所述RPA-F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述RPA-R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.如權利要求1所述的生物傳感器，其特征在于，所述ssDNA的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。

4.如權利要求1~3任一項所述的生物傳感器，其特征在于，所述磁性共價有機骨架為Fe₃O₄@COF。

5.權利要求1~4任一項所述的生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

將磁性共價有機骨架、Pd-Au、水和MB混合，進行負載，得到磁性共價有機骨架/Pd-Au/MB；

將所述磁性共價有機骨架/Pd-Au/MB、水和CP2探針混合，得到CP2探針/磁性共價有機骨架/Pd-Au/MB反應液；

將crRNA溶液和Cas12a溶液混合后，采用第一緩沖液進行稀釋，進行crRNA的前體識別，加入待檢樣品后，進行目標物的識別，最后加入ssDNA溶液，進行酶促反應，加入蛋白酶，進行Cas12a的酶切反應，得到CRSPR/Cas12a體系反應液；所述第一緩沖液中包括Mg²⁺；

在基底電極表面鍍金后，依次滴加CP1探針溶液、CRSPR/Cas12a體系反應液和CP2探針/磁性共價有機骨架/Pd-Au/MB反應液，得到所述生物傳感器。

6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述第一緩沖液中Mg²⁺的濃度為5~30mM。

7.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述crRNA的前體識別的溫度為27~42℃；

所述目標物的識別的時間為5~30min；

所述酶促反應的時間為10~60min；

所述crRNA溶液和Cas12a溶液的體積比為（8~12）：（3~6）；

所述crRNA溶液的濃度為1150~1250ng/μL，所述Cas12a溶液的濃度為500pmol/L。

8.一種檢測ctDNA的電化學系統，其特征在于，包括生物傳感器、參比電極和輔助電極；

所述生物傳感器為權利要求1~4任一項所述的生物傳感器或權利要求5~7任一項所述的制備方法制備得到的生物傳感器。