[發明專利]一種生物傳感器及其制備方法和應用、檢測ctDNA的電化學系統

有效

• 申請號: 202111414807.6
• 申請日: 2021-11-25
• 公開（公告）號: CN114088783B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發明（設計）人: 趙卉;李燦鵬;張亞平;劉鳳
• 申請（專利權）人: 云南大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26;G01N27/30;G01N27/327
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 霍苗

本發明涉及ctDNA的檢測技術領域，尤其涉及一種生物傳感器及其制備方法和應用、檢測ctDNA的電化學系統。本發明提供的包括基底電極和依次負載在所述基底電極表面的Au?CP1探針層、HT層、CRSPR/Cas12a體系層和CP2探針/磁性共價有機骨架/Pd?Au/MB層；所述CRSPR/Cas12a體系層包括crRNA、Cas12a、ssDNA和待檢樣品，所述CP2探針/磁性共價有機骨架/Pd?Au/MB層包括磁性共價有機骨架和負載在所述磁性共價有機骨架的孔隙結構中的Pd?Au和MB，還包括CP2探針；所述Pd?Au中的Au與CP2探針中的巰基鍵合，該生物傳感器便于攜帶，能夠特異性檢測ctDNA。

技術領域

本發明涉及ctDNA的檢測技術領域，尤其涉及一種生物傳感器及其制備方法和應用、檢測ctDNA的電化學系統。

背景技術

肺癌是目前世界上公認的發病率和死亡率較高的惡性腫瘤，所以精準快速的早期診斷對于肺癌患者的臨床治療和預后具有極其重要的意義。在肺癌中有約80%是非小細胞肺癌（NSCLC），其惡性程度高，預后較差。臨床研究表明，超過60%的NSCLC高表達表皮生長因子受體（EGFR），EGFR已被認為是治療NSCLC的重要治療靶點。大多數EGFR突變發生在18~21外顯子中的酪氨酸激酶結構域。在大多數情況下，21號外顯子突變（EGFR L858R）占這些突變的40%~45%。EGFR L858R對靶向藥物，如吉非替尼或厄洛替尼等酪氨酸激酶抑制劑（TKIS）高度敏感，這些藥物在腫瘤患者治療中療效顯著。因此，在臨床治療中檢測EGFR L858R突變對NSCLC治療和預后是必要的。

目前，臨床上EGFR基因突變檢測的主要手段是對術后切除組織進行測序，這種方法有創傷且不能重復采樣，因而具有很大的局限性。針對上述問題，液體活檢技術則具有微創或無創的特性，同時能動態監測腫瘤變化情況和可重復取樣等優點，具有強大的潛力和發展前景。

循環腫瘤DNA（ctDNA）是其中一類重要的液體活檢腫瘤標志物，可全面反映腫瘤細胞的基因變異情況，能實時動態地反映出腫瘤細胞的發展和治療過程中的變化，是一種高敏感、高特異、具備廣泛應用前景的血液腫瘤標志物。研究結果顯示，ctDNA EGFR基因的突變在NSCLC患者的敏感性和特異性分別為78%和100%。因此，EGFR L858R在EGFR-TKIS的治療指導，療效評估和預后評估中發揮重要作用，因此，ctDNA EGFR L858R是一種具備廣泛應用前景的血液腫瘤標志物。

目前，NSCLC患者ctDNA EGFR的檢測方法主要分為兩大類：一大類為基于聚合酶鏈式反應PCR的檢測方法；另一類是基于高通量測序的檢測方法。這些方法雖然靈敏，但由于依賴于熱循環擴增、昂貴的儀器設備和專業人員的操作，因此很大程度限制了檢測方法的推廣運用。為此，急需開發一種靈敏、特異、低成本、可床旁檢測（POCT）的新方法。

近年來研究發現CRISPR/Cas系統具有獨特的靶向性，為開發針對核酸為底物的生物傳感器提供了全新的方向。CRISPR/Cas系統具有獨特的靶向性，其中CRISPR/Cas12a系統的識別目標物可以是RNA也可以是DNA；當Cas12a蛋白在CRISPR RNA（crRNA）的引導下結合到靶標后會識別RNA或DNA目標，從而激活Cas核酸酶，并啟動反式切割活性對附近的單鏈非靶向核酸不加區分地進行剪切，且能在3小時后仍能保持活躍。近兩年來對于CRISPR/Cas的核酸檢測體系大多是用熒光的方法對病毒或者miRNA進行了檢測。熒光檢測法需要較大的儀器，不利于攜帶。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種生物傳感器及其制備方法和應用、檢測ctDNA的電化學系統，所述生物傳感器便于攜帶，且能夠特異性檢測ctDNA。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種生物傳感器，包括基底電極和依次負載在所述基底電極表面的Au-CP1探針層、巰基乙醇層（HT層）、CRISPR/Cas12a體系層和CP2探針/磁性共價有機骨架/Pd-Au/MB層；