[發(fā)明專利]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合人脫細(xì)胞真皮的方法及制得的組織工程皮膚在修復(fù)皮膚缺損中的用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111411900.1
• 申請日: 2021-11-25
• 公開（公告）號: CN114099788A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 季子云;李杰
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州鳳喆凰生物科技有限公司
• 主分類號: A61L27/60
• 分類號: A61L27/60;A61L27/38;A61L27/36;C12N5/0775
• 代理公司: 天津市尚儀知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 12217
• 代理人: 孫喬喬

本發(fā)明公開了一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合人脫細(xì)胞真皮的方法及制得的組織工程皮膚在修復(fù)皮膚缺損中的用途，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。采用本發(fā)明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合人脫細(xì)胞真皮的方法制備獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合人脫細(xì)胞真皮對皮膚缺損創(chuàng)面具有很好的促進(jìn)愈合作用，尤其是對難愈性創(chuàng)面，如大面積深度燒傷，燒傷殘余創(chuàng)面，壓瘡，骨質(zhì)、肌腱缺損，腫瘤切除術(shù)后，慢性潰瘍創(chuàng)面等也具有一定的促進(jìn)愈合的作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合人脫細(xì)胞真皮的方法及制得的組織工程皮膚在修復(fù)皮膚缺損中的用途。

背景技術(shù)

皮膚作為人體的天然保護屏障，對維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和阻止外界微生物的入侵具有重要的作用。各種原因引起的皮膚缺損在臨床上十分常見，目前最常用的治療方法是通過自體皮移植，同種異體皮或異種皮移植，以及復(fù)合皮移植等。但這些方法具有供區(qū)不足，皮源緊張，免疫排斥及傳播疾病等缺點。因此，尋找更好的皮膚代替物來治療皮膚缺損顯得尤為必要。

隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，組織工程皮膚的研究逐漸成為熱點，多種類型的組織工程皮膚開始應(yīng)用到臨床，并取得了良好的效果。構(gòu)建組織工程皮膚的種子細(xì)胞和支架材料多種多樣，選擇合適的種子細(xì)胞和支架材料以及探索合適的構(gòu)建方法，將直接影響到組織工程皮膚對皮膚缺損修復(fù)的效果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，所提出了一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合人脫細(xì)胞真皮的方法及制得的組織工程皮膚在修復(fù)皮膚缺損中的用途。

本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案。

一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合人脫細(xì)胞真皮的方法，包括以下步驟：

a.將脫細(xì)胞真皮放入細(xì)胞培養(yǎng)板上，加入完全培養(yǎng)基浸泡18-24h，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育 1-2h；

b.將處于對數(shù)生長期的第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用 0.25％胰蛋白酶液消化，消化3-5min后終止消化，吹打懸浮細(xì)胞，收集懸液，1200-1500rpm/min離心5-8min，棄上清；采用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在37℃孵育 36-60h，1200-1500rpm/min離心5-8min，棄上清，再次重懸細(xì)胞；

c按細(xì)胞密度10³-10⁵/孔將步驟b中獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于含有脫細(xì)胞真皮的細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于 37℃，5％C0₂ ，95％濕度的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天換液一次，觀察細(xì)胞成活及生長情況。

進(jìn)一步的，步驟a中，脫細(xì)胞真皮的制備方法如下：人源真皮清洗消毒后，用低滲溶液反復(fù)浸泡清洗皮膚；將清洗后的皮膚用2-3mg/mL DispaseⅡ溶液處理過夜；將處理后的皮膚去除表皮，用生理鹽水清洗；將獲得的真皮用0.1-1mol/L Ca²⁺的高滲鹽溶液處理18-36h；棄去高滲溶液用生理鹽水清洗；將清洗后的真皮置于脫細(xì)胞液中，處理3-5h；最后將脫細(xì)胞真皮用生理鹽水清洗。

進(jìn)一步的，所述脫細(xì)胞液包括以下成分：0.1-0.5％胰酶，0.5-1%SDS。

進(jìn)一步的，步驟b中，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法如下：在無菌條件下用含有肝素抗凝劑的干細(xì)胞培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集骨髓懸液并用D-Hanks液稀釋，在離心管加入Ficoll分離液，將稀釋后的骨髓懸液緩慢加在Ficoll分離液上，1500-2000rpm/min離心10-20分鐘，收集富含有核細(xì)胞的界面層細(xì)胞并用D-Hanks液清洗，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×10⁴-10⁵/ml接種于的培養(yǎng)瓶，在37℃、5％CO₂、飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)。