[發明專利]骨髓間充質干細胞復合人脫細胞真皮的方法及制得的組織工程皮膚在修復皮膚缺損中的用途

在審

• 申請號: 202111411900.1
• 申請日: 2021-11-25
• 公開（公告）號: CN114099788A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 季子云;李杰
• 申請（專利權）人: 杭州鳳喆凰生物科技有限公司
• 主分類號: A61L27/60
• 分類號: A61L27/60;A61L27/38;A61L27/36;C12N5/0775
• 代理公司: 天津市尚儀知識產權代理事務所(普通合伙) 12217
• 代理人: 孫喬喬

1.一種骨髓間充質干細胞復合人脫細胞真皮的方法，其特征在于：包括以下步驟：

a.將脫細胞真皮放入細胞培養板上，加入完全培養基浸泡18-24h，置于37℃培養箱中孵育 1-2h；

b.將處于對數生長期的第3代骨髓間充質干細胞用 0.25％胰蛋白酶液消化，消化3-5min后終止消化，吹打懸浮細胞，收集懸液，1200-1500rpm/min離心5-8min，棄上清；采用完全培養基重懸細胞，在37℃孵育 36-60h，1200-1500rpm/min離心5-8min，棄上清，再次重懸細胞；

c按細胞密度10³-10⁵/孔將步驟b中獲得的骨髓間充質干細胞接種于含有脫細胞真皮的細胞培養板中，置于 37℃，5％C0₂ ，95％濕度的無菌培養箱中培養，每隔2-3天換液一次，觀察細胞成活及生長情況。

2.根據權利要求1所述的一種骨髓間充質干細胞復合人脫細胞真皮的方法，其特征在于：步驟a中，脫細胞真皮的制備方法如下：人源真皮清洗消毒后，用低滲溶液反復浸泡清洗皮膚；將清洗后的皮膚用2-3mg/mL DispaseⅡ溶液處理過夜；將處理后的皮膚去除表皮，用生理鹽水清洗；將獲得的真皮用0.1-1mol/L Ca²⁺的高滲鹽溶液處理18-36h；棄去高滲溶液用生理鹽水清洗；將清洗后的真皮置于脫細胞液中，處理3-5h；最后將脫細胞真皮用生理鹽水清洗。

3.根據權利要求2所述的一種骨髓間充質干細胞復合人脫細胞真皮的方法，其特征在于：所述脫細胞液包括以下成分：0.1-0.5％胰酶，0.5-1%SDS。

4.根據權利要求1所述的一種骨髓間充質干細胞復合人脫細胞真皮的方法，其特征在于：步驟b中，所述骨髓間充質干細胞的分離培養方法如下：在無菌條件下用含有肝素抗凝劑的干細胞培養基反復沖洗骨髓腔，收集骨髓懸液并用D-Hanks液稀釋，在離心管加入Ficoll分離液，將稀釋后的骨髓懸液緩慢加在Ficoll分離液上，1500-2000 rpm/min離心10-20分鐘，收集富含有核細胞的界面層細胞并用D-Hanks液清洗，調整細胞濃度為 1×10⁴-10⁵/ml接種于的培養瓶，在37℃、5％CO₂、飽和濕度條件下靜置培養。

5.根據權利要求1所述的一種骨髓間充質干細胞復合人脫細胞真皮的方法，其特征在于：步驟b中，所述骨髓間充質干細胞的傳代方法如下：細胞長至瓶底的 80%-90%進行傳代，用無菌 PBS 沖洗細胞后加入 0.25%胰蛋白酶液，消化1-2min后終止消化，吹打懸浮細胞，收集懸液，1200-1500rpm/min離心5-8min，棄上清；采用完全培養基重懸細胞于培養瓶中，2-3 天傳代一次。

6.一種權利要求1-5任一所述的骨髓間充質干細胞復合人脫細胞真皮的方法制備獲得的組織工程皮膚。

7.一種權利要求6所述的組織工程皮膚在修復皮膚缺損中的用途。